利用Cytiva 分離材料與層析技術(shù)高效分步純化中藥蛋白

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，中醫(yī)藥學(xué)是中國古代科學(xué)的瑰寶。TCM是傳統(tǒng)中藥的簡稱 (Traditional Chinese Medicine) ，包括植物、動(dòng)物、礦物質(zhì)。重要的化學(xué)成分極其復(fù)雜，有效成分種類很多，諸如多糖、多肽、生物堿、黃酮、萜、有機(jī)酸、甚至蛋白等。其中具體有效成分是如何被分離出來的呢？
  
紅參多糖
人參相信大家都很熟悉，紅參是以新鮮人參為原料，經(jīng)過浸潤、清洗、蒸制、烘干等步驟制得。紅參再中國、韓國、日本等東亞國家作為中藥或膳食補(bǔ)充劑被廣泛使用已有千年之久。在此研究之前已有多項(xiàng)研究表明紅參可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善心肌缺血，具有保護(hù)心臟的作用。
 
多數(shù)研究關(guān)注在人參皂苷組分上，除此之外，還有一個(gè)不能忽視的活性組分，那就是多糖。人參在加工成紅參過程中，原有的糖類發(fā)生了不同程度水解產(chǎn)生新的糖類，有趣的是，紅參中多糖抗氧化活性顯著高于人參多糖，且同樣具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、清除自由基等功能。中國藥科大學(xué)賈曉斌教授/封亮副教授課題組在Chinese Medicine雜志上發(fā)表了題為《Characterization of a novel polysaccharide from red ginseng and its ameliorative effect on oxidative stress injury in myocardial ischemia》的文章，文章中提取純化了紅參多糖組分RGP1-1，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過實(shí)驗(yàn)，猜測(cè)其通過抗氧化能力保護(hù)氧化損傷以及調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路，預(yù)防及治療心肌缺血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RGP1-1對(duì)心肌缺血損傷具有明顯保護(hù)作用，為開發(fā)紅參多糖作為功能性食品和代替藥物提供了科學(xué)依據(jù)。
 
在此項(xiàng)研究中，作者首先使用沸水對(duì)紅參水提2h，提取液在65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液再加入95%乙醇進(jìn)行沉淀，4℃孵育過夜。離心后的樣品用Sewage法去除蛋白組分，凍干得到粗多糖RGP。蒸餾水溶解粗多糖RGP，使用DEAE-52弱陰離子交換層析柱進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分測(cè)定多糖含量，收集多糖含量最高的組分，濃縮、透析、凍干。上述凍干組分蒸餾水溶解后，進(jìn)一步使用Sephadex G-100分子篩層析柱進(jìn)行精純，得到RGP1-1，收集的組分干燥后做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析及功能研究，純化步驟參見圖3。
 
結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，高劑量 (400 mg/kg) RGP1-1紅參多糖處理后的心肌細(xì)胞與陽性對(duì)照組結(jié)果相似，心臟組織得到部分修復(fù)，細(xì)胞浸潤和壞死較少，心肌細(xì)胞未見明顯纖維化、增殖、炎癥、退變現(xiàn)象，說明RGP1-1具有明顯的心臟保護(hù)作用。后續(xù)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，RGP1-1處理的組織，Nfr2蛋白明顯升高，進(jìn)而調(diào)節(jié)解毒酶核抗氧化酶基因NQO1、HO-1和keap-1蛋白的表達(dá)，以降低氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷。RGP1-1通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路實(shí)現(xiàn)預(yù)防及治療心肌缺血作用。
 
中藥有效成分在層析法純化中，多使用離子交換層析，包括Capto Q, Capto DEAE, Capto SP系列等，配合分子篩Sephadex LH-20，Superdex系列，Sephacryl系列以及換液脫鹽的Sephadex系列。此外，中高壓的反相層析SOURCE 15RPC/ 30RPC也經(jīng)常使用。 

Cytiva（思拓凡）——用于有機(jī)溶劑的 Sephadex LH-20 填料
Cytiva Sephadex LH-20填料專門用于天然產(chǎn)物（如類固醇、萜類化合物、脂質(zhì)和低分子量肽）的制備級(jí)純化，同樣也是TCM分離純化的一柄利器。
 
Sephadex LH-20填料的主要特點(diǎn)與性質(zhì)
填料同時(shí)具有凝膠過濾層析和吸附型層析的復(fù)合層析模式。
填料由交聯(lián)Sephadex G-25葡聚糖凝膠經(jīng)過羥丙基化制成。
干粉填料的平均顆粒粒徑是70 μm，在甲醇中溶脹后的填料平均顆粒粒徑是103 μm。
填料的工作pH耐受范圍以及清洗pH耐受范圍都是2-13，這意味著填料可以耐受絕大多數(shù)水相緩沖液和有機(jī)溶劑，除了pH低于2的強(qiáng)酸溶液以及濃度超過0.1 M NaOH的強(qiáng)堿溶液。
Sephadex LH-20填料可以耐受濕熱滅菌，即121攝氏度20分鐘的高溫高壓滅菌。
排阻信息：4000–5000 Da（取決于所使用的溶劑種類），大于排阻極限的生物分子走外水出峰，其他小分子進(jìn)入凝膠層。
使用時(shí)推薦的線性流速：60 cm/h。
 
成功用于已發(fā)表研究
Sephadex LH-20填料可用于研究用途的脂質(zhì)分離和純化復(fù)雜有機(jī)物如中藥，成功的研究案例包括：
多肽及非多肽抗生素；
脂質(zhì)及去垢劑；
毒素及污染物；
類固醇、鞣酸以及植物提取物，如臺(tái)灣相思樹莖皮抗氧化劑活性、玉米花粉和蜜蜂蜂巢花粉的自由基清除活性、赤松松針的抗氧化劑活性等。

探尋中藥蛋白更高效的分步純化策略，離不開對(duì)優(yōu)質(zhì)分離材料的精準(zhǔn)選擇與技術(shù)方案的科學(xué)適配。從紅參多糖RGP1-1的純化歷程中不難看出，DEAE-52離子交換層析與Sephadex G-100分子篩層析的組合應(yīng)用，為中藥活性成分的精準(zhǔn)分離提供了成功范式。而Cytiva（思拓凡）的Sephadex LH-20填料憑借復(fù)合層析模式、寬pH耐受范圍、穩(wěn)定的物化性質(zhì)以及在植物提取物等天然產(chǎn)物純化中的豐富成功案例，更展現(xiàn)出其在中藥復(fù)雜成分分離中的強(qiáng)大潛力——其不僅能適配有機(jī)溶劑體系，還可與離子交換層析、反相層析等技術(shù)形成互補(bǔ)，為中藥蛋白的分步純化提供靈活且高效的支撐。
 
未來，隨著中藥現(xiàn)代化研究的深入，對(duì)蛋白等活性成分的純化需求將更趨精準(zhǔn)化、高效化。Cytiva等專注于分離純化技術(shù)的企業(yè)所提供的優(yōu)質(zhì)填料與配套方案，將成為破解中藥蛋白純化難題的重要助力。