通過腎臟代謝的激活型NIR-II金納米探針實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟GSH實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

本文要點(diǎn)：谷胱甘肽（GSH）在維持腎臟氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，因此實(shí)現(xiàn)腎臟GSH的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)早期診斷與預(yù)防腎臟氧化還原失衡具有重要意義。本研究設(shè)計(jì)出智能激活型、腎臟可清除的近紅外二區(qū)金納米簇（Au NCs），用于腎臟GSH表達(dá)水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。所設(shè)計(jì)的金納米簇經(jīng)血液運(yùn)輸至腎臟后，被腎內(nèi)GSH快速激活并產(chǎn)生近紅外二區(qū)熒光；更重要的是，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)茴三硫（ATT）和丁硫氨酸-亞砜亞胺（L-BSO）藥物誘導(dǎo)的腎臟GSH變化的原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。此外，激活后的金納米簇可通過尿液快速清除排泄。該成果為腎臟GSH表達(dá)水平的原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了新策略。

方案1. 腎臟GSH激活和可清除NIR-II熒光Au-NCs的設(shè)計(jì)圖，用于原位監(jiān)測(cè)腎臟GSH水平

本研究設(shè)計(jì)出快速響應(yīng)型、腎臟可清除的金納米簇（Au NCs），用于腎臟內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)近紅外二區(qū)監(jiān)測(cè)。該無近紅外二區(qū)熒光特性的金納米簇通過在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中還原氯金酸制備而成。實(shí)驗(yàn)表明，該金納米簇可被GSH快速激活，在808 nm光激發(fā)下產(chǎn)生濃度依賴性的近紅外二區(qū)發(fā)射，其對(duì)GSH的檢測(cè)限低至∼0.14 μM。更重要的是，體內(nèi)近紅外二區(qū)成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)：腎臟內(nèi)的GSH成功激活了金納米簇的近紅外二區(qū)熒光，其發(fā)射強(qiáng)度與腎臟GSH表達(dá)水平密切關(guān)聯(lián)。此外，激活后的金納米簇可快速代謝至膀胱，最終經(jīng)尿液排出體外。

圖1. Au NCs合成示意圖和表征

金納米簇（Au NCs）的制備過程如示意圖1和圖1a所示：在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中利用NaBH4還原HAuCl4，制備出無近紅外二區(qū)熒光的金納米簇。透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖1b）表明成功制備出分散性和穩(wěn)定性優(yōu)異的金納米簇，其尺寸約為2納米，且在48小時(shí)內(nèi)未觀察到顯著尺寸變化，證實(shí)其具有良好的穩(wěn)定性。為探究金納米簇與谷胱甘肽（GSH）的相互作用，測(cè)試了二者混合后的吸收光譜。結(jié)果顯示混合后金納米簇的光吸收能力增強(qiáng)（圖1c）。通過TEM觀測(cè)混合體系發(fā)現(xiàn)，金納米簇與GSH結(jié)合形成了Au NCs-GSH復(fù)合物。進(jìn)一步測(cè)量復(fù)合物的zeta電位表明：隨著GSH濃度增加，復(fù)合物的zeta電位逐漸降低（圖1d），這主要?dú)w因于更高濃度的GSH與金納米簇結(jié)合。最后，利用X射線光電子能譜（XPS）研究了二者的結(jié)合機(jī)制：XPS譜圖顯示復(fù)合物中金呈現(xiàn)0價(jià)和+1價(jià)態(tài)，而硫元素形成了Au-S鍵（圖1e-g），證實(shí)了金納米簇與GSH的高效結(jié)合。

圖2. 金納米簇（Au NCs）的GSH激活NIR-II熒光研究

本研究設(shè)計(jì)的金納米簇（Au NCs）本身不具備近紅外二區(qū)發(fā)射特性。當(dāng)與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合后，其金屬內(nèi)核重構(gòu)為金屬-配體復(fù)合物，從而激活近紅外二區(qū)熒光發(fā)射（圖2a）�；�于配體-金屬-金屬電荷轉(zhuǎn)移（LMMCT）機(jī)制（46,47），熒光強(qiáng)度隨GSH濃度梯度升高而增強(qiáng)。為驗(yàn)證該激活特性，測(cè)試了不同濃度GSH激活的金納米簇近紅外二區(qū)發(fā)射光譜：如圖2b所示，其發(fā)射強(qiáng)度與GSH濃度呈正相關(guān)，發(fā)射峰位于1000 nm附近。利用近紅外二區(qū)成像系統(tǒng)進(jìn)一步考察GSH激活的熒光成像性能，圖2c,d顯示金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度與GSH濃度呈現(xiàn)優(yōu)異線性關(guān)系，對(duì)GSH的檢測(cè)限達(dá)0.14微摩爾/升，證實(shí)其卓越的GSH響應(yīng)能力。為驗(yàn)證特異性，將金納米簇與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、半胱氨酸、H₂O₂、ClO⁻等活性物質(zhì)混合后進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。如圖2e,f及圖S6所示，僅當(dāng)GSH作為激活劑時(shí)金納米簇才呈現(xiàn)明亮的近紅外二區(qū)發(fā)射，表明該材料可被GSH特異性激活。通過延時(shí)成像考察響應(yīng)速率：含GSH的金納米簇溶液在數(shù)分鐘內(nèi)熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)（圖2g,h），10分鐘后增速顯著放緩，而對(duì)照組始終無熒光產(chǎn)生，證明GSH能快速激活其近紅外二區(qū)發(fā)射。最后考察Au NCs-GSH體系的光穩(wěn)定性：經(jīng)808 nm激光持續(xù)照射10分鐘后，金納米簇仍保持穩(wěn)定的近紅外二區(qū)發(fā)射（圖2i,j）。綜上，該金納米簇對(duì)GSH具有高響應(yīng)性、快速響應(yīng)速度、優(yōu)異特異性及高光穩(wěn)定性，在近紅外二區(qū)成像檢測(cè)體內(nèi)GSH方面展現(xiàn)出良好潛力。

圖3. 4T1腫瘤和腎臟NIR-II成像研究

為探究體內(nèi)GSH的檢測(cè)性能，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)腫瘤及腎臟GSH進(jìn)行了原位近紅外二區(qū)成像（圖3a）。在進(jìn)行內(nèi)源性GSH檢測(cè)前，首先開展外源性GSH體內(nèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：將等體積PBS溶液與GSH溶液分別注射至小鼠背部左右兩側(cè)皮下，隨后在注射部位注入等量金納米簇溶液。如圖3b,c所示，GSH注射部位在40分鐘內(nèi)近紅外二區(qū)信號(hào)急劇增強(qiáng)，這很可能源于預(yù)先注射的GSH與金納米簇快速結(jié)合；而PBS注射部位則未觀察到明顯熒光變化。通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)器官損傷評(píng)估進(jìn)一步考察金納米簇的生物安全性。圖3d顯示CCK-8實(shí)驗(yàn)表明金納米簇對(duì)4T1細(xì)胞無顯著毒性。此外，通過尾靜脈注射金納米簇前（0天）及注射后（1天、3天）采集小鼠血清樣本，檢測(cè)腎功能標(biāo)志物肌酐（CREA）和血尿素氮（BUN）水平。

隨后將金納米簇用于4T1腫瘤檢測(cè)（圖3a）。原位注射金納米簇溶液后，小鼠腫瘤部位出現(xiàn)明亮的近紅外二區(qū)發(fā)射（圖3e,f），表明腫瘤部位GSH成功激活了金納米簇的熒光發(fā)射。鑒于金納米簇尺寸僅約2納米，其具備腎臟GSH原位近紅外二區(qū)成像的潛力。研究者在注射金納米簇溶液后對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行近紅外二區(qū)成像（圖3a）。本實(shí)驗(yàn)中，僅注射金納米簇溶液的小鼠作為對(duì)照組，而行雙側(cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后注射金納米簇的小鼠作為結(jié)扎組。圖3g,h顯示：注射金納米簇30分鐘后，對(duì)照組小鼠腎臟區(qū)域呈現(xiàn)強(qiáng)近紅外二區(qū)熒光，膀胱區(qū)域也觀察到類似發(fā)光現(xiàn)象，這可能是由于腎臟內(nèi)GSH激活金納米簇后代謝至膀胱所致；而結(jié)扎組小鼠的腎臟和膀胱區(qū)域均未檢測(cè)到近紅外二區(qū)信號(hào)，證實(shí)金納米簇主要在腎臟內(nèi)被激活。后續(xù)分別采集對(duì)照組與結(jié)扎組的腎臟、肝臟、血液及尿液樣本進(jìn)行成像分析。結(jié)果（圖3i-k）表明：對(duì)照組腎臟與尿液樣本顯示出強(qiáng)近紅外二區(qū)信號(hào)，而肝臟和血液樣本幾乎無信號(hào)；結(jié)扎組的肝臟、腎臟、血液及尿液樣本均未觀察到顯著信號(hào)（圖3i-k），進(jìn)一步驗(yàn)證了金納米簇的腎臟GSH激活特性。因此，本研究設(shè)計(jì)的金納米簇探針可被腎臟GSH快速激活，并能通過尿液迅速排出體外。

圖4. 利用金納米簇原位監(jiān)測(cè)腎臟GSH水平的近紅外二區(qū)成像

為驗(yàn)證所設(shè)計(jì)金納米簇對(duì)腎臟GSH水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)能力，研究通過茴三硫（ATT）和丁硫氨酸-亞砜亞胺（L-BSO）分別上調(diào)和下調(diào)GSH表達(dá)，構(gòu)建了兩種腎臟GSH水平不同的小鼠模型（圖4a）。如圖4b所示，L-BSO處理組小鼠腎臟GSH表達(dá)顯著降低，而ATT處理組則顯著升高，表明不同腎臟GSH水平的小鼠模型構(gòu)建成功。隨后向ATT組、L-BSO組及正常小鼠靜脈注射等量金納米簇溶液，監(jiān)測(cè)其背部與腹部近紅外二區(qū)成像：圖4c,d顯示ATT組小鼠腎臟信號(hào)顯著強(qiáng)于正常組，而L-BSO組腎臟信號(hào)則弱于對(duì)照組；膀胱區(qū)域信號(hào)變化趨勢(shì)與腎臟一致（圖4e,f）。收集小鼠尿液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATT組尿液近紅外二區(qū)信號(hào)最強(qiáng)，L-BSO組最弱（圖4g）。離體器官成像結(jié)果顯示僅腎臟呈現(xiàn)顯著信號(hào)，其強(qiáng)度變化趨勢(shì)與前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符（圖4h,i），證實(shí)該金納米簇能高效實(shí)現(xiàn)腎臟GSH水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

本研究設(shè)計(jì)出一種具有快速腎臟清除特性的激活型高靈敏度GSH特異性近紅外二區(qū)熒光納米簇（金納米簇），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腎臟GSH表達(dá)水平。當(dāng)接觸GSH時(shí)，金納米簇迅速形成復(fù)合物（Au NCs-GSH）并開啟近紅外二區(qū)熒光，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)限達(dá)0.14微摩爾/升的GSH檢測(cè)。該納米簇可通過血液循環(huán)在腎臟快速激活并排泄。更重要的是，在藥物誘導(dǎo)小鼠模型中成功實(shí)現(xiàn)了腎臟GSH的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)近紅外二區(qū)熒光監(jiān)測(cè)，其熒光強(qiáng)度與GSH表達(dá)水平密切關(guān)聯(lián)，表明該技術(shù)能對(duì)腎臟GSH水平進(jìn)行高精度特異性成像。

參考文獻(xiàn)

Wen, Xingwang, et al. "Activatable and Renal Metabolizable NIR-II Emissive Au Nanoprobe for Real-Time Monitoring of Kidney GSH." Nano Letters (2025).

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