抗體藥物偶聯(lián)物ADC的作用機(jī)制、設(shè)計(jì)要素及選擇要求

ADC藥物簡(jiǎn)介
抗體藥物偶聯(lián)物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 是一種將高選擇性的單克隆抗體 (Monoclonal Antibody,mAb) 和強(qiáng)細(xì)胞毒性的小分子化學(xué)藥物即有效載荷 (Payload) 通過(guò)連接子 (Linker) 偶聯(lián)而獲得的藥物（圖1）。ADC結(jié)合了單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性以及細(xì)胞毒性藥物的強(qiáng)大腫瘤殺傷力，且克服了單抗的細(xì)胞毒性弱和細(xì)胞毒性藥物系統(tǒng)毒性大的問(wèn)題，具有1+1>2的治療優(yōu)勢(shì)。

ADC的作用機(jī)制復(fù)雜，通常需要藥物內(nèi)化，然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)處理和有效載荷釋放。ADC作用的典型模型假設(shè)如下：抗體與目標(biāo)抗原的結(jié)合，隨后內(nèi)化，經(jīng)內(nèi)體運(yùn)輸進(jìn)入溶酶體，在溶酶體中ADC的連接子或抗體部分降解并釋放出有效載荷，有效載荷則進(jìn)一步發(fā)揮作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。但實(shí)際情況更為復(fù)雜，并且ADC之間存在明顯差異（圖2）。

 

ADC藥物設(shè)計(jì)要素
1、靶抗原（Target Antigen）
ADC藥物設(shè)計(jì)起始于靶抗原，其選擇需滿足：
（1）特異性，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)、正常細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)；
（2）為腫瘤細(xì)胞表面抗原；
（3）能高效誘導(dǎo)內(nèi)化過(guò)程等。

靶點(diǎn)蛋白的選擇直接關(guān)系到ADC的靶向性、治療效果以及安全性。愛必信深耕靶點(diǎn)蛋白研發(fā)領(lǐng)域，擁有超過(guò) 2800 種高質(zhì)量靶點(diǎn)蛋白資源庫(kù)，其中ADC熱門靶點(diǎn)蛋白全覆蓋，廣泛應(yīng)用于免疫原制備、高通量抗體篩選、細(xì)胞信號(hào)通路研究及功能機(jī)制驗(yàn)證等場(chǎng)景。

 

大部分ADC藥物的療效主要基于內(nèi)化后藥物釋放，即抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合形成的ADC-抗原復(fù)合物，需有效誘導(dǎo)內(nèi)化，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，實(shí)現(xiàn)小分子藥物釋放。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光將ADC內(nèi)化情況可視化（圖3），DT3C含量檢測(cè)定量?jī)?nèi)化效率（圖4）。

DT3C(Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2,C3)是一種重組表達(dá)的融合蛋白，該蛋白能夠與抗體的Fc端高度親和，與抗體結(jié)合的DT3C分子在抗體被內(nèi)吞時(shí)一同進(jìn)入細(xì)胞。DT3C可以與任何lgG型抗體結(jié)合，因此可用于檢測(cè)來(lái)自不同物種的抗體內(nèi)化效率。

 

2、抗體（Antibody）
ADC藥物中的抗體需要滿足：高特異性、強(qiáng)靶點(diǎn)結(jié)合能力、低免疫原性、低交叉反應(yīng)活性，以達(dá)到腫瘤細(xì)胞對(duì)ADC藥物更高效的攝入和ADC藥物在血清中更長(zhǎng)的半衰期。

免疫球蛋白G (IgG) 是ADC中使用的主要抗體骨架。所以，臨床和臨床前研究的ADC藥物通常選擇IgG作為靶向目的抗原的抗體。IgGs可分為四個(gè)亞型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 。其中，IgG1由于能夠較好地平衡長(zhǎng)血液半衰期和強(qiáng)免疫激活的關(guān)系，并且有著較高的自然豐度，是被研究和采用最多的ADC抗體。IgG4由于較低的免疫激活效應(yīng)也經(jīng)常被采用在一些對(duì)免疫原性反應(yīng)要求較高的ADC藥物設(shè)計(jì)中。

圖5 不同IgG對(duì)比^[2]

3、有效載荷（Payload）
ADC所攜帶的細(xì)胞毒性載荷藥物即有效載荷是其最重要的效應(yīng)成分。目前，常用的細(xì)胞毒性分子包括微管生成抑制劑、DNA 損傷因子和DNA轉(zhuǎn)錄抑制劑等。

選擇小分子藥物時(shí)，需要滿足：
（1）IC50值低至納摩爾級(jí)別甚至皮摩爾級(jí)別；
（2）在與抗體偶聯(lián)后不易引起ADC藥物發(fā)生聚集，以保證在體內(nèi)擁有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間；
（3）本身以及形成后的ADC藥物需具有較低的免疫原性；
（4）在水溶液（血液）中足夠穩(wěn)定且具有合適的反應(yīng)位點(diǎn)通過(guò)連接子與抗體偶聯(lián)，偶聯(lián)后仍然能夠保證其生物活性；
（5）可以通過(guò)相對(duì)具有經(jīng)濟(jì)效益的過(guò)程合成。

4、連接子（Linker）
連接子（Linker）在ADC結(jié)果中起著至關(guān)重要的作用，其會(huì)影響ADC的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、治療指數(shù)和藥效。Linker可維持ADC復(fù)合物在血流中的穩(wěn)定性，并最大限度地減少非靶向效應(yīng)。而且，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)化ADC的過(guò)程中，Linker應(yīng)能夠快速釋放細(xì)胞毒性藥物。

根據(jù)可裂解性質(zhì)Linker分為可裂解Linker和非可裂解Linker，可裂解Linker可進(jìn)一步分為腙、二硫化物和肽Linker三種類型（表1）。非可裂解Linker包括不可降解的硫醚或馬來(lái)酰亞胺己�；�（Maleimidocaproyl，MC），其在ADC中Payload內(nèi)化至靶癌細(xì)胞后經(jīng)溶酶體酶降解。合理選擇和優(yōu)化Linker及其與Payload的偶聯(lián)策略可有效提高ADC的治療效果和減少脫靶效應(yīng)。

類型	特征
腙	酸敏感性腙Linker在癌細(xì)胞內(nèi)體和溶酶體的低pH（4-6）下容易發(fā)生酸水解，這有利于有效釋放Payload。
二硫化物	二硫鍵Linker在血液循環(huán)中具有良好的穩(wěn)定性，它們利用癌細(xì)胞內(nèi)較高濃度的谷胱甘肽進(jìn)行釋放。癌細(xì)胞富含谷胱甘肽，這與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和缺氧所導(dǎo)致的高度應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)。
肽	溶酶體蛋白酶敏感肽如：組織蛋白酶B可作用于在腫瘤細(xì)胞內(nèi)切割A(yù)DC的二肽鍵的腫瘤特異性蛋白酶；纈氨酸瓜氨酸是一種組織蛋白酶B敏感型二肽；β-葡萄糖醛酸酶是一種在許多腫瘤中過(guò)量表達(dá)的酶，β-葡萄糖醛酸對(duì)該酶較敏感，可被其降解和水解，故可將β-葡萄糖醛酸作為蛋白酶敏感的Linker用于選擇性地釋放Payload。

5、偶聯(lián)技術(shù)
偶聯(lián)技術(shù)將抗體與有效載荷相連，和最終的藥物抗體比率（Drug to Antibody Ratio, DAR）密切相關(guān)。DAR 為每個(gè) mAb 連接的有效載荷平均數(shù)量，可經(jīng) HPLC - MS 等測(cè)得，對(duì)藥物藥理學(xué)和活性影響顯著，是 ADC 研發(fā)后期關(guān)鍵參數(shù)。因腫瘤細(xì)胞攝入 ADC 數(shù)量有限，較高 DAR 有利于提高效力，但小分子藥物疏水性強(qiáng)，DAR 過(guò)高會(huì)使 ADC 聚集，縮短體內(nèi)循環(huán)半衰期且增加毒副作用，故臨床前和臨床用DAR 通常在 2 - 8 之間。

偶聯(lián)方式主要分為非定點(diǎn)偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)。早期使用的是非定點(diǎn)偶聯(lián)法，主要由賴氨酸或半胱氨酸偶聯(lián)。定點(diǎn)偶聯(lián)方式即通過(guò)基因工程位點(diǎn)進(jìn)行特異性偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)更均一的ADC，能在特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的連接。

酶學(xué)偶聯(lián)法
Sortase A（abs05842）通過(guò)識(shí)別目標(biāo)蛋白上的特定肽序列，通常是LPXTG（X可以是任何氨基酸），并在蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）殘基之間進(jìn)行切割（圖6）。Sortase A介導(dǎo)的抗體偶聯(lián)（SMAC）技術(shù)允許在抗體上預(yù)先設(shè)定的位點(diǎn)上高效地將毒素偶聯(lián)到抗體上，獲得DAR值均一且高度穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。

圖 6 轉(zhuǎn)肽酶/分選酶（Sortase）及轉(zhuǎn)肽反應(yīng)

基于氮葡聚糖工程技術(shù)的偶聯(lián)策略
采用基于β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)。在體外，可利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)引入末端唾液酸。這些唾液酸可經(jīng)高碘酸鹽氧化產(chǎn)生醛基，并進(jìn)一步通過(guò)肟鍵與Payload共價(jià)偶聯(lián)。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)在于：無(wú)論N-Glycan的異質(zhì)性如何，該策略皆具有較高的可重復(fù)性，因此可用于含各種N-Glycan的任何mAb與Payload的偶聯(lián)。

愛必信ADC毒素抗體定點(diǎn)偶聯(lián)試劑盒（abs580253）操作簡(jiǎn)便，無(wú)需抗體工程化等復(fù)雜操作，可快速實(shí)現(xiàn)單抗的定點(diǎn)偶聯(lián)。偶聯(lián)產(chǎn)物均一、穩(wěn)定。適用于偶聯(lián)階段定點(diǎn)偶聯(lián)，ADC早期偶聯(lián)研究。

偶聯(lián)原理：
（1）抗體疊氮化修飾

首先使用糖苷酶（EndoS）暴露單抗恒定區(qū)的保守N糖鏈上的乙酰葡糖糖胺（藍(lán)色方塊），然后使用牛半乳糖轉(zhuǎn)移酶突變體（b.GalTY298L）將帶有疊氮官能團(tuán)的乙酰半乳糖胺（黃色方塊-N3）連在乙酰葡萄糖胺上。

（2）毒素分子連接

隨后可使用無(wú)銅催化的炔疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)（如SPAAC）將生物素、熒光素或毒素分子（如：endo-BCN-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，abs823512）等連在單抗上。

驗(yàn)證數(shù)據(jù)

 

ADC工藝開發(fā)、CMC和臨床前研究
ADC 藥物生產(chǎn)涵蓋抗體、細(xì)胞毒藥物/連接子、ADC 原料藥及制劑三大模塊，各模塊均需工藝開發(fā)與驗(yàn)證，且要制定工程細(xì)胞、起始原料及試劑的質(zhì)控要求。偶聯(lián)生產(chǎn)用中間體質(zhì)控靈活，考驗(yàn)工藝與質(zhì)控體系研發(fā)能力，抗體和細(xì)胞毒素性質(zhì)差異使生產(chǎn)挑戰(zhàn)大，工藝表征研究對(duì)后續(xù)批次意義重大。CMC 研究有 4 部分：1. 抗體；2. 載荷-連接子中間體；3. ADC原料藥；4. 制劑部分。同時(shí)，還應(yīng)引入藥物抗體比率、連接位點(diǎn)、藥物負(fù)載分布等特殊質(zhì)控指標(biāo)，并控制游離載荷和抗體，研究其對(duì)結(jié)合效力及血漿穩(wěn)定性的影響。

由于ADC的復(fù)雜性和多樣性，以及生物樣本中釋放的細(xì)胞毒藥物含量較低等原因，對(duì)藥代動(dòng)力學(xué) (PK) 和藥效學(xué) (PD) 表征提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。此外，在安全性評(píng)價(jià)中生物分析方法的選擇和檢測(cè)的準(zhǔn)確性也是考量要素。

在藥代動(dòng)力學(xué) (PK) 和藥效學(xué) (PD) 研究中， 我們提供全面的實(shí)驗(yàn)試劑和技術(shù)服務(wù)支持（液相芯片(Luminex)檢測(cè)服務(wù)、超敏電化學(xué)發(fā)光（MSD）、DSP空間多組學(xué)），產(chǎn)品和服務(wù)覆蓋了從基礎(chǔ)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到復(fù)雜組織分析的全流程，為藥理學(xué)和毒理學(xué)研究提供一站式解決方案。

相關(guān)ADC產(chǎn)品推薦

分類	貨號(hào)	產(chǎn)品名稱
ADC抗體內(nèi)化檢測(cè)	abs05842	Recombinant Aureus Sortase A Protein
	abs47038871	溶酶體紅色熒光探針（FluoLyso Red）
	abs47038872	溶酶體深紅色熒光探針（FluoLyso Deep Red）
	abs90007	快速FITC 抗體(蛋白)標(biāo)記試劑盒
ADC細(xì)胞毒素	abs814234	Daun02
	abs818801	Aldoxorubicin
	abs818814	Campathecin
	abs819122	MMAF-OMe
	abs821144	Vipivotide tetraxetan
	abs822859	McMMAF
ADC Linker	abs814183	Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP
	abs818426	Val-cit-PAB-OH
	abs818997	Fmoc-Val-Cit-PAB
	abs820984	MC-Val-Cit-PAB
	abs823299	Indole-C2-amide-C2-NH2
	abs823510	DBCO-acid
ADC Linker with Payload	abs819056	Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE
	abs823508	N3-PEG3-vc-PAB-MMAE
	abs823509	Azido-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE
	abs823511	DBCO-PEG4-VC-Cit-PAB-MMAE
	abs823512	endo-BCN-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE
	abs823513	DBCO-(PEG)3-VC-PAB-MMAE
ADC定點(diǎn)偶聯(lián)試劑盒	abs580253	ADC毒素抗體定點(diǎn)偶聯(lián)試劑盒

參考文獻(xiàn)
[1] Kyoji Tsuchikama, et al. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell. 2018Jan;9(1):33-46
[2] Joshua Z Drago, et al. Unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):327-344.