外泌體純化核心方法的對比分析
胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），主要包括約 40-160 nm（平均 100 nm）的外泌體（Exosomes，EXOs），50-1000 nm 的微囊泡（Microvesicles，MVs）和 50-2000 nm 的凋亡小體（Apoptotic bodies，APOs）[1][2]。其中，微囊泡為細胞膜直接向胞外出芽產(chǎn)生；而外泌體的產(chǎn)生需要經(jīng)過兩次質(zhì)膜內(nèi)陷，第一次為細胞膜通過胞吞作用內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，并逐漸演變?yōu)槌墒斓耐砥趦?nèi)體。內(nèi)體通過內(nèi)出芽的方式（即第二次膜內(nèi)陷），形成包含很多腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）的多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs 與細胞質(zhì)膜融合釋放 ILVs，即外泌體。到達靶細胞后，通過和膜上受體互作直接啟動胞內(nèi)信號通路，也可以通過膜融合或胞吞作用釋放內(nèi)含物。
外泌體的分離方法比較
傳統(tǒng)的分離方法，主要基于外泌體的大小和密度等內(nèi)在特征以及免疫親和特性。幾種常見的分離方法比較如下：
超速離心法：基于顆粒組成和溶質(zhì)的密度、大小和形狀進行連續(xù)分離。降低了使用分離試劑造成的污染和成本。樣本處理量大、產(chǎn)量高。但儀器成本投入高，笨重，運行時間長，耗人力，不便攜。超速離心可能破壞外泌體而影響下游分析。經(jīng)常存在雜蛋白和脂蛋白污染。
基于大小的分離技術(shù)：基于外泌體和其他顆粒組分的大小差異。超濾：快速，不需要特殊儀器，便攜。將 RNA 提取液經(jīng)膜可直接用于 RNA 抽提。分子排阻層析（Size Exclusion Chromatography, SEC）：較高純度外泌體，通常在重力流下操作從而保留了外泌體的完整性和生物活性�？芍貜托院茫卸葮颖咎幚砹�。但儀器成本低，中等純度。剪切力可引起外泌體損傷。有可能造成聚集和囊泡陷入膜孔中，或外泌體吸附在膜上而損失。SEC：儀器成本中等，需要專用的設(shè)備。不易放大，運行時間長。
外泌體沉淀：使用聚合物如 PEG，通過改變外泌體的可溶性或分散性進行分離。容易操作，不需要特殊儀器。樣本處理量大，具有可放大性。但缺乏選擇性的分離機制，容易和非外泌體污染共沉淀，如其他囊泡、蛋白聚合物。去除游離蛋白等，運行時間長，需要在富集前去除高度蛋白等亞細胞顆粒，在分離后去除聚合物材料。
免疫親和捕獲技術(shù)：通過外泌體膜結(jié)合型抗原和固定化抗體之間的特異性相互作用進行分離。針對特定來源或亞群的外泌體分離是很好的選擇。相比于其它分離方法，純度要高出很多，利于外泌體的分型。但是試劑成本高，需要預先確認好的外泌體標簽（抗原）。樣本處理量低，只有帶標簽的外泌體被識別而產(chǎn)量低。僅適用于 cell-free 樣品。腫瘤的異質(zhì)性妨礙了免疫識別，可能會造成假陰性。抗原表位可能被封閉或隱藏。
微流控技術(shù)：微尺度下，基于外泌體的生理和生化特性進行分離，如免疫親和特性、大小和密度，結(jié)合新興的聲波納濾、電磁和電泳等技術(shù)�？焖�、低成本、高度便攜、容易實現(xiàn)自動化，可將外泌體分離和后續(xù)檢測進行集成。但缺乏標準化和大規(guī)模的臨床樣本測試，缺少方法驗證，低中等程度的樣本處理量。
外泌體純化產(chǎn)品推薦
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
Capto™ 填料基于堅硬的高流動性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結(jié)構(gòu)，可提供良好的壓力和流動性。這種填料旨在用于工藝開發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實驗室。它們的高流速可提高生產(chǎn)率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設(shè)計，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過表層進入填料內(nèi)部核心，核心層可以結(jié)合雜質(zhì)分子。這一設(shè)計使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點。該系列填料的優(yōu)點包括高載量、高流速、短保留時間、在寬操作窗口內(nèi)保持強大性能、工藝設(shè)計簡單和生產(chǎn)效率高。
新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結(jié)合特性。
產(chǎn)品優(yōu)點：
• 新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結(jié)合特性。
• 新型核心層析技術(shù)可高效捕獲污染物，同時在流穿過程中收集靶分子。
• 與標準分子排阻（凝膠過濾）方法相比，顯著提高了生產(chǎn)率并提高了流速。
• 通過流穿層析法和穩(wěn)定的性能進行直接優(yōu)化。
• 使用預填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進行便捷的小規(guī)模純化、工藝開發(fā)和規(guī)模擴大。
• 填料可滿足供應安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過外殼的孔進入核內(nèi)。在層析柱流穿過程中收集這些較大分子，而較小雜質(zhì)與內(nèi)化配基結(jié)合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內(nèi)核配基具有疏水性同時帶正電荷，從而可對小至足以進入核心的各種污染物進行高效多模式結(jié)合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內(nèi)與大多數(shù)雜質(zhì)強結(jié)合。通過使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結(jié)合的雜質(zhì)。
規(guī)模放大較為簡單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開發(fā)高效且可靠的分離方法時可方便使用。
Cytiva（思拓凡）——ÄKTA flux 切向流過濾系統(tǒng)
ÄKTA fluxTM 過濾系統(tǒng)是一種多功能切向流過濾(TFF)系統(tǒng)，用于樣品濃縮和洗濾(緩沖液交換)以及細胞收獲和澄清(圖1)。該系統(tǒng)允許使用盒式濾筒、中空纖維濾芯和膜吸附器輕松過濾。AKTA 助焊劑系統(tǒng)有兩個版本:用于研究、過濾器篩選和小規(guī)模生產(chǎn)的 ÄKTA 助焊劑系統(tǒng)以及用于工藝開發(fā)和小規(guī)模生產(chǎn)的 ÄKTA助焊劑6系統(tǒng)半自動化功能可實現(xiàn)端點控制、恒定保留容積(CRV)和數(shù)據(jù)記錄。這些功能可以騰出時間用于實驗室的其他任務(wù)。通過易于使用的觸摸屏，可以方便地監(jiān)控和處理工藝信息和控制。該系統(tǒng)可以處理較低的工作量，以支持廣泛的濃度因子。AKTA助焊劑過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白質(zhì)純化和澄清，作為 AKTATM 色譜系統(tǒng)的補充。
產(chǎn)品優(yōu)勢：
·低工作體積支持多種濃縮倍數(shù)。
·靈活地處理允許使用中空纖維膜柱和膜包。
·多功能設(shè)計可用于超濾和微濾應用。
·有兩種版本可選：ÄKTA flux s 適合研究和過濾器篩選，ÄKTA flux 6 適合工藝開發(fā)和放大實驗。
·Cytiva 針對自動化一次性過濾，推出了 ÄKTA readyflux。
輕松過濾
半自動化功能可實現(xiàn)終端控制（例如恒定回流體積 (CRV)）和數(shù)據(jù)記錄，讓操作員有更多時間處理實驗室中的其他任務(wù)。通過易于使用的觸摸屏即可方便地監(jiān)控和處理過程信息和過程控制。
可處理低工作液量
ÄKTA flux 系統(tǒng)可以處理低工作液量和循環(huán)液量，從而能夠支持多種濃縮倍數(shù)。ÄKTA flux 過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白純化流程，是對 ÄKTA 層析系統(tǒng)的補充。
外泌體的純化是解析其生物學功能、推動臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提，選擇適宜的分離方法與可靠的純化產(chǎn)品，能顯著提升研究效率與結(jié)果準確性。上述提及的超速離心法、免疫親和捕獲技術(shù)等經(jīng)典方法，以及Cytiva（思拓凡）的Capto Core 700多模式層析填料、ÄKTA flux切向流過濾系統(tǒng)等產(chǎn)品，為不同研究場景（從實驗室小規(guī)模探索到工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)）提供了多元解決方案。未來，隨著外泌體研究的不斷深入，分離純化技術(shù)將朝著更高效、高純度、標準化、自動化的方向迭代，而優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的持續(xù)創(chuàng)新也將為這一領(lǐng)域的突破提供堅實支撐。研究者可根據(jù)自身實驗需求（如樣本量、純度要求、成本預算、是否需要規(guī)模化放大等），靈活組合或優(yōu)化技術(shù)方案，助力外泌體在疾病診斷、治療載體等領(lǐng)域的研究與應用邁向新高度。
外泌體的分離方法比較
傳統(tǒng)的分離方法，主要基于外泌體的大小和密度等內(nèi)在特征以及免疫親和特性。幾種常見的分離方法比較如下：
超速離心法：基于顆粒組成和溶質(zhì)的密度、大小和形狀進行連續(xù)分離。降低了使用分離試劑造成的污染和成本。樣本處理量大、產(chǎn)量高。但儀器成本投入高，笨重，運行時間長，耗人力，不便攜。超速離心可能破壞外泌體而影響下游分析。經(jīng)常存在雜蛋白和脂蛋白污染。
基于大小的分離技術(shù)：基于外泌體和其他顆粒組分的大小差異。超濾：快速，不需要特殊儀器，便攜。將 RNA 提取液經(jīng)膜可直接用于 RNA 抽提。分子排阻層析（Size Exclusion Chromatography, SEC）：較高純度外泌體，通常在重力流下操作從而保留了外泌體的完整性和生物活性�？芍貜托院茫卸葮颖咎幚砹�。但儀器成本低，中等純度。剪切力可引起外泌體損傷。有可能造成聚集和囊泡陷入膜孔中，或外泌體吸附在膜上而損失。SEC：儀器成本中等，需要專用的設(shè)備。不易放大，運行時間長。
外泌體沉淀：使用聚合物如 PEG，通過改變外泌體的可溶性或分散性進行分離。容易操作，不需要特殊儀器。樣本處理量大，具有可放大性。但缺乏選擇性的分離機制，容易和非外泌體污染共沉淀，如其他囊泡、蛋白聚合物。去除游離蛋白等，運行時間長，需要在富集前去除高度蛋白等亞細胞顆粒，在分離后去除聚合物材料。
免疫親和捕獲技術(shù)：通過外泌體膜結(jié)合型抗原和固定化抗體之間的特異性相互作用進行分離。針對特定來源或亞群的外泌體分離是很好的選擇。相比于其它分離方法，純度要高出很多，利于外泌體的分型。但是試劑成本高，需要預先確認好的外泌體標簽（抗原）。樣本處理量低，只有帶標簽的外泌體被識別而產(chǎn)量低。僅適用于 cell-free 樣品。腫瘤的異質(zhì)性妨礙了免疫識別，可能會造成假陰性。抗原表位可能被封閉或隱藏。
微流控技術(shù)：微尺度下，基于外泌體的生理和生化特性進行分離，如免疫親和特性、大小和密度，結(jié)合新興的聲波納濾、電磁和電泳等技術(shù)�？焖�、低成本、高度便攜、容易實現(xiàn)自動化，可將外泌體分離和后續(xù)檢測進行集成。但缺乏標準化和大規(guī)模的臨床樣本測試，缺少方法驗證，低中等程度的樣本處理量。
外泌體純化產(chǎn)品推薦
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
Capto™ 填料基于堅硬的高流動性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結(jié)構(gòu)，可提供良好的壓力和流動性。這種填料旨在用于工藝開發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實驗室。它們的高流速可提高生產(chǎn)率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設(shè)計，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過表層進入填料內(nèi)部核心，核心層可以結(jié)合雜質(zhì)分子。這一設(shè)計使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點。該系列填料的優(yōu)點包括高載量、高流速、短保留時間、在寬操作窗口內(nèi)保持強大性能、工藝設(shè)計簡單和生產(chǎn)效率高。
新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結(jié)合特性。
產(chǎn)品優(yōu)點：
• 新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結(jié)合特性。
• 新型核心層析技術(shù)可高效捕獲污染物，同時在流穿過程中收集靶分子。
• 與標準分子排阻（凝膠過濾）方法相比，顯著提高了生產(chǎn)率并提高了流速。
• 通過流穿層析法和穩(wěn)定的性能進行直接優(yōu)化。
• 使用預填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進行便捷的小規(guī)模純化、工藝開發(fā)和規(guī)模擴大。
• 填料可滿足供應安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過外殼的孔進入核內(nèi)。在層析柱流穿過程中收集這些較大分子，而較小雜質(zhì)與內(nèi)化配基結(jié)合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內(nèi)核配基具有疏水性同時帶正電荷，從而可對小至足以進入核心的各種污染物進行高效多模式結(jié)合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內(nèi)與大多數(shù)雜質(zhì)強結(jié)合。通過使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結(jié)合的雜質(zhì)。
規(guī)模放大較為簡單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開發(fā)高效且可靠的分離方法時可方便使用。
ÄKTA fluxTM 過濾系統(tǒng)是一種多功能切向流過濾(TFF)系統(tǒng)，用于樣品濃縮和洗濾(緩沖液交換)以及細胞收獲和澄清(圖1)。該系統(tǒng)允許使用盒式濾筒、中空纖維濾芯和膜吸附器輕松過濾。AKTA 助焊劑系統(tǒng)有兩個版本:用于研究、過濾器篩選和小規(guī)模生產(chǎn)的 ÄKTA 助焊劑系統(tǒng)以及用于工藝開發(fā)和小規(guī)模生產(chǎn)的 ÄKTA助焊劑6系統(tǒng)半自動化功能可實現(xiàn)端點控制、恒定保留容積(CRV)和數(shù)據(jù)記錄。這些功能可以騰出時間用于實驗室的其他任務(wù)。通過易于使用的觸摸屏，可以方便地監(jiān)控和處理工藝信息和控制。該系統(tǒng)可以處理較低的工作量，以支持廣泛的濃度因子。AKTA助焊劑過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白質(zhì)純化和澄清，作為 AKTATM 色譜系統(tǒng)的補充。
產(chǎn)品優(yōu)勢：
·低工作體積支持多種濃縮倍數(shù)。
·靈活地處理允許使用中空纖維膜柱和膜包。
·多功能設(shè)計可用于超濾和微濾應用。
·有兩種版本可選：ÄKTA flux s 適合研究和過濾器篩選，ÄKTA flux 6 適合工藝開發(fā)和放大實驗。
·Cytiva 針對自動化一次性過濾，推出了 ÄKTA readyflux。
輕松過濾
半自動化功能可實現(xiàn)終端控制（例如恒定回流體積 (CRV)）和數(shù)據(jù)記錄，讓操作員有更多時間處理實驗室中的其他任務(wù)。通過易于使用的觸摸屏即可方便地監(jiān)控和處理過程信息和過程控制。
可處理低工作液量
ÄKTA flux 系統(tǒng)可以處理低工作液量和循環(huán)液量，從而能夠支持多種濃縮倍數(shù)。ÄKTA flux 過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白純化流程，是對 ÄKTA 層析系統(tǒng)的補充。
外泌體的純化是解析其生物學功能、推動臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提，選擇適宜的分離方法與可靠的純化產(chǎn)品，能顯著提升研究效率與結(jié)果準確性。上述提及的超速離心法、免疫親和捕獲技術(shù)等經(jīng)典方法，以及Cytiva（思拓凡）的Capto Core 700多模式層析填料、ÄKTA flux切向流過濾系統(tǒng)等產(chǎn)品，為不同研究場景（從實驗室小規(guī)模探索到工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)）提供了多元解決方案。未來，隨著外泌體研究的不斷深入，分離純化技術(shù)將朝著更高效、高純度、標準化、自動化的方向迭代，而優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的持續(xù)創(chuàng)新也將為這一領(lǐng)域的突破提供堅實支撐。研究者可根據(jù)自身實驗需求（如樣本量、純度要求、成本預算、是否需要規(guī)模化放大等），靈活組合或優(yōu)化技術(shù)方案，助力外泌體在疾病診斷、治療載體等領(lǐng)域的研究與應用邁向新高度。
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