流式抗體染色操作流程（含表面/胞內）
流式抗體指可以應用于流式實驗的抗體，與ELISA、WB、IF等實驗抗體相比，通常不需要過于復雜的樣本處理和實驗步驟，同時檢測的是活細胞或者固定細胞，可以獲得單細胞多參數的定量結果。流式抗體又分為未標記的和熒光標記的，未標記的流式抗體需要配合相應二抗使用，熒光標記的流式抗體自帶熒光不需要二抗。尚恩生物提供的流式抗體是經過熒光標記，可以直接與處理后的樣本進行孵育，然后通過流式細胞儀檢測，若需未標記的流式抗體，可以聯系銷售人員咨詢。
流式抗體染色流程
一、細胞表面染色操作流程
1、細胞計數
將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數；若為貼壁細胞，需要先用胰酶消化細胞，300g離心5min，去上清。
2、制備單細胞懸液
將收集的細胞用1mL 預冷0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x107個細胞/mL，取100μL細胞懸液置于流式管內。
3、（可選）阻斷Fc受體
可用抗體同源血清全IgG抗體與細胞充分混勻，室溫孵育10-20min。
4、一抗孵育
每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管，使細胞和抗體充分反應。若為直標抗體，需要避光反應，跳到步驟7�？贵w稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。
5、洗滌
300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
6、二抗孵育
對于非熒光染料直標抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管。
7、洗滌
300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
8、上機分析
用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
二、細胞胞內染色操作流程
1、細胞計數
將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數；若為貼壁細胞，需要先用胰酶消化細胞，300g離心5min，去上清。
2、制作單細胞懸液
將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x107個細胞/mL，取100μL細胞懸液置于流式管內，300g離心5min去上清。
3、固定
每管加入100μL細胞固定劑重懸細胞，2-8°孵育20min。固定劑可用4% 多聚甲醛。
4、洗滌
600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
5、通透
每管加入100μL細胞通透劑重懸細胞，室溫孵育20min。通透劑可用0.5%BSA/PBS（0.3%TritonX-100）
6、洗滌
600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
7、（可選）阻斷Fc受體
用抗體同源血清全IgG抗體與細胞充分混勻，室溫10-20min。
8、一抗孵育
每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管，使細胞和抗體充分反應。若為直標抗體，需要避光反應，跳到步驟11。抗體稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。
9、洗滌
600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
10、二抗孵育
對于非熒光染料直標抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管。對于直標抗體直接跳到步驟11。
11、洗滌
600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
12、上機分析
用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
注：
實驗建議設置空白對照，同型對照，空白對照不加一抗，同型對照將一抗替換為同型抗體。
