斜向光熱顯微鏡實現(xiàn)活體亞微米分辨率的高靈敏度紅外光譜成像

紅外光譜成像在活體研究中面臨靈敏度低和分辨率差的挑戰(zhàn)，尤其是在反射模式下。為了突破這一瓶頸，本研究報道了一種斜向光熱顯微鏡（Oblique Photothermal Microscope, OPTM），實現(xiàn)了活體亞微米分辨率的高靈敏度紅外光譜成像。傳統(tǒng)光熱測量僅通過光圈捕獲少量探針光子來提取光熱信號，而OPTM采用差分分裂檢測器放置在樣品表面，收集更多光子并通過平衡檢測抑制激光噪聲。憑借其提升的靈敏度，OPTM能夠在無光損傷條件下對皮膚進行低劑量紅外成像。實驗展示了小鼠和人類皮膚下層代謝標記物的深度分辨活體成像，并追蹤了局部藥物在皮膚內(nèi)的分布。OPTM為活體原位分子分析提供了一個高靈敏度成像平臺。

本論文的重要發(fā)現(xiàn)者包括Mingsheng Li、Sheng Xiao、Hongli Ni、Guangrui Ding、Yuhao Yuan、Carolyn Marar、Jerome Mertz和Ji-Xin Cheng。他們共同發(fā)表的論文“Ultrasensitive in vivo infrared spectroscopic imaging via oblique photothermal microscopy”于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與仿真結(jié)果
斜向光熱顯微鏡（OPTM）的核心創(chuàng)新在于其檢測策略的變革。傳統(tǒng)中紅外光熱（MIP）顯微鏡在反射模式下使用光圈過濾后向散射光子，導致光子收集效率低。OPTM則通過將差分分裂檢測器直接置于樣品表面，收集斜向傳播的探針光子，從而大幅提升信號捕獲能力。仿真結(jié)果顯示，OPTM的光子收集效率比傳統(tǒng)方法提高約500倍，同時通過平衡檢測將激光噪聲抑制12倍。這種設計利用光熱調(diào)制引起的折射率變化，生成光熱相位梯度信號，作為分子敏感性的高效讀出機制。

OPTM儀器設計包括脈沖紅外激光和連續(xù)波可見激光作為泵浦和探針源，通過反射中繼光學和反射物鏡減少色差。信號處理流程將分裂檢測器的輸出分為AC和DC成分，通過鎖相放大和向量運算生成光熱相位梯度圖像和吸收圖像，實現(xiàn)實時分子成像。

活體小鼠皮膚成像展示了OPTM在生物醫(yī)學中的潛力。通過多光譜成像，OPTM區(qū)分了脂肪細胞中的游離脂肪酸和脂質(zhì)酯，其信噪比優(yōu)于傳統(tǒng)MIP顯微鏡8倍。深度分辨成像揭示了皮膚不同層（如角質(zhì)層、表皮層）的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分布，分辨率達亞微米級。

藥物追蹤實驗進一步凸顯了OPTM的應用價值。對局部施用過氧化苯甲酰（BPO）的活體小鼠皮膚進行深度成像，結(jié)合LASSO光譜解混算法，量化了藥物在毛囊中的遞送效率。結(jié)果顯示，BPO主要通過毛囊開口滲透，但效率低于30%，為藥物開發(fā)提供了新見解。

人類皮膚成像實驗證實了OPTM的臨床適用性。在志愿者前臂皮膚中，OPTM無創(chuàng)可視化了代謝標記物和藥物分布，展示了其在健康診斷和透皮藥物監(jiān)測中的前景。OPTM通過斜向光熱檢測機制，實現(xiàn)了高靈敏度、高分辨率的活體紅外成像。其技術(shù)優(yōu)勢包括提升的光子收集效率、有效的噪聲抑制以及深度分辨能力，為生物醫(yī)學研究提供了強大工具。

創(chuàng)新與亮點
01突破成像難題
OPTM解決了活體紅外光譜成像的兩大核心難題：靈敏度和分辨率不足。傳統(tǒng)技術(shù)如傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和光聲紅外顯微鏡受限于衍射極限和光子衰減，無法在活體中實現(xiàn)微米級成像。OPTM通過斜向檢測策略，將光子收集效率提升500倍，噪聲抑制12倍，打破了活體應用的壁壘。其亞微米分辨率克服了紅外波長的衍射限制，使納米級化學可視化在活體中成為可能。

總結(jié)與展望
OPTM技術(shù)通過斜向光熱檢測機制，顯著提升了活體紅外光譜成像的靈敏度和分辨率，為分子級生物醫(yī)學研究開辟了新道路。其創(chuàng)新性體現(xiàn)在光子收集效率的優(yōu)化和噪聲抑制策略上，成功應用于小鼠和人類皮膚的代謝標記物成像及藥物追蹤。未來，通過使用更長波長的探針光源，OPTM有望進一步增加穿透深度，擴展至更復雜的組織成像。此外，結(jié)合計算重建方法如希爾伯特變換，可以提升圖像質(zhì)量，減少偽影。OPTM作為一個平臺技術(shù)，不僅限于中紅外窗口，還可適配于其他光熱顯微鏡系統(tǒng)，推動其在基礎(chǔ)研究和臨床翻譯中的廣泛應用�？傊�，OPTM代表了活體分子成像的重要進展，有望在疾病診斷和藥物開發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

DOI:10.1038/s41467-025-61332-w.