分子克隆的常用方式及特點

分子克隆（Molecular Cloning）是指將目的DNA片段（如一個基因）從復(fù)雜的基因組中“復(fù)制”出來，并將其插入到一種能夠自主復(fù)制的載體（如質(zhì)粒）中，再將這個重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞（如大腸桿菌）進行擴增和表達(dá)的過程。簡單來說，它就是一個“復(fù)制+粘貼”的過程，只不過操作對象是DNA分子。

分子克隆的常用方式

1.1 酶切連接
酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性內(nèi)切酶切割目的基因DNA和載體DNA，再利用DNA連接酶連接DNA，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實驗圓滿完成的必要條件。分子克隆技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。粘性末端，即限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈上交錯切割，形成的核苷酸順序互補的，可形成氫鍵的末端（見圖2）；平末端，限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段（見圖3）。

圖2 EcoRI切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

愛必信擁有目前常用的如快速內(nèi)切酶BsaI（abs60206）、快速內(nèi)切酶AgeI（abs60338）、快速內(nèi)切酶EcoRI（abs60213）、快速內(nèi)切酶HindIII（abs60217）等在內(nèi)的70款限制性內(nèi)切酶（詳情點擊：https://www.absin.cn/restriction-enzyme.html）

✅快速：5-15min內(nèi)即可完成酶切；
✅便捷：共用一種酶切Buffer，簡化酶切體系；
✅兼容性高：在不同緩沖液中均具有極高活性；
✅種類齊全：輕松應(yīng)對各類酶切實驗。

核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被稱為生物界的“502”。在有Mg²⁺和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5´-磷酸末端和3´-羥基末端形成磷酸二酯鍵。

1.2 TOPO克隆
TOPO克隆實際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡便快捷的方法，實現(xiàn)“切-粘”一步完成。

TOPO克隆特點：
1）適用于連接平末端和帶3’-A的PCR產(chǎn)物。
2）連接反應(yīng)僅需5min。
3）陽性率高：無自連、零背景，無需藍(lán)白斑篩選，陽性克隆比例高，極少出現(xiàn)空載體。

表1愛必信TOPO克隆產(chǎn)品

愛必信快速多片段無縫克隆預(yù)混液（abs60619，為abs60250的升級版）特點：
✅極速高效：最快5min即可完成克隆，陽性率超過95%；
✅操作簡單：無需酶切連接，一步反應(yīng)即可完成單/多片段組裝；
✅高保真度：HiFi高保真連接酶，顯著提高成功率；
✅優(yōu)化升級：優(yōu)化配方，穩(wěn)定性更強，可耐受熱、氧等環(huán)境。

圖4 愛必信快速多片段無縫克隆預(yù)混液（abs60619）操作流程

愛必信分子克隆系列部分產(chǎn)品清單