L-NAME作為一氧化氮合酶(NOS)抑制劑在心血管及免疫研究中的應用

L-NAME（NG-nitro-L-arginine methyl ester）是一種廣泛應用的一氧化氮合酶（NOS）抑制劑。L-NAME（AbMole，M2818）是探索一氧化氮（NO）信號通路在心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中生理與病理作用的基石性工具化合物。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。

一、L-NAME的作用原理
一氧化氮（NO）作為一種信號分子，廣泛參與細胞增殖、血管舒張、神經(jīng)傳遞、免疫應答等多種生理過程，其功能異常與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)病變、炎癥紊亂等多種病理狀態(tài)密切相關。NO的生物合成依賴一氧化氮合酶（NOS）的催化作用，該酶以L -精氨酸為底物，在輔酶（如NADPH、FAD、FMN）參與下生成NO與L-瓜氨酸。根據(jù)組織分布與功能差異，NOS主要分為神經(jīng)元型（nNOS）、誘導型（iNOS）和內(nèi)皮型（eNOS）三類。L-NAME對上述三種NOS均具有抑制活性。L-NAME（N'-硝基-L-精氨酸甲酯） 的分子結(jié)構(gòu)與 NOS 的天然底物 L-精氨酸高度相似，二者均可競爭性結(jié)合NOS的活性中心。L-NAME 與 NOS 的結(jié)合常數(shù)（Ki 值）要低于L-精氨酸的米氏常數(shù)（Km 值），因此在同等濃度下，L-NAME 可優(yōu)先占據(jù) NOS 活性中心，阻斷L-精氨酸的結(jié)合。結(jié)合后的 L-NAME 可通過其分子中的硝基（-NO₂）與 NOS 活性中心的血紅素基團形成穩(wěn)定的配位鍵，導致酶的構(gòu)象改變，進一步抑制 NOS 的催化活性。

二、L-NAME（51298-62-5）的科研應用

1. L-NAME用于動物高血壓模型的構(gòu)建
L-NAME（NG-Nitroarginine methyl ester，AbMole，M2818）可通過抑制NOS，減少NO的生物合成，后者的缺乏將導致血管收縮功能異常，最終可建立高血壓動物模型。L-NAME誘導的動物高血壓模型特征包括血壓升高、血管張力異常及氧化應激增強。例如L-NAME可誘導Wistar大鼠的高血壓模型，使用劑量為50 mg/kg/Day，結(jié)果顯示L-NAME處理后的大鼠的收縮壓升高（收縮壓≈80mmHg）^[1]。在另一項研究中，L-NAME通過飲用水給予C57BL/6基因編輯小鼠，給藥方案為50 mg/kg/day（1-17周），100 mg/kg/day（18-21周），在結(jié)合高鹽飲食后成功構(gòu)建了小鼠的高血壓模型^[2]。此外，L-NAME的動物給藥方式十分便捷，一般可將其溶于水中進行喂食或者通過腹腔進行注射^[3]。在聯(lián)合高脂飲食（HFD）時，L-NAME還能誘發(fā)心臟舒張功能障礙（HFpEF）和腎臟纖維化，為代謝性疾病的研究提供模型^[4]。L-NAME還能用于構(gòu)建先兆子癇動物模型，例如L-NAME在Wistar大鼠中通過自由飲水的方式給藥，誘導大鼠出現(xiàn)先兆子癇的經(jīng)典癥狀^[5]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內(nèi)實驗，相關科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

 

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圖 1. Systolic blood pressures during L-NAME and high-salt administration.

2. L-NAME用于心肌缺血再灌注損傷的研究
L-NAME還被用于研究 NO 信號通路在心肌缺血再灌注（I/R）損傷中的作用機制。例如L-NAME（劑量為30 μM，在缺血前10分鐘和缺血期間，通過加入灌注液的形式給藥）在白化Wistar大鼠的心肌I/R損傷模型中，抑制了蒲公英提取物對大鼠心臟的保護^[6]。L-NAME（100 μmol/l，靜脈注射）還可以逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對SD大鼠心肌I/R損傷模型的保護作用，表明NO是白藜蘆醇發(fā)揮功能的機制之一^[7]。

 

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圖 2. 白藜蘆醇抑制SD大鼠心肌I/R模型中的梗塞比例^[7]

3. L-NAME用于炎癥與免疫調(diào)控研究
NOS 在炎癥刺激（如脂多糖 LPS、細胞因子）誘導下可大量表達，生成的NO 作為免疫效應分子參與病原體清除與炎癥反應調(diào)控。L-NAME（NG-Nitroarginine methyl ester，AbMole，M2818）通過抑制NOS可以揭示NO在免疫過程中的功能。例如L-NAME 通過降低腫瘤細胞的NO和巨噬細胞的TNF-α來抑制 r/m HM-SFME-1 細胞的腫瘤細胞進展和肺轉(zhuǎn)移。在上述實驗中，動物模型為Balb/c小鼠，L-NAME 的劑量為1mg/mL，通過小鼠飲用水給藥^[8]。L-NAME還在II型膠原誘導的C57/B10小鼠關節(jié)炎（CIA）模型中，通過抑制NOS，減少NO和RNS（活性氮）的生成，限制了T細胞的活化，并因此對大鼠CIA起到預防作用。在上述研究中，L-NAME給藥方式為腹腔注射或者經(jīng)口給藥，劑量分別為4.3mg/100μL/小鼠和416 mg/L（混入小鼠飲用水中）^[9]。

 

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圖 3. Treatments of L-NAME suppress CIA in mice^[9]

三、范例詳解

1. Neurotherapeutics, Volume 21, Issue 1, January 2024, e00301
西班牙瓦倫西亞大學的實驗人員在上述論文中研究了肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）的病理機制與潛在干預策略。通過兩種 ALS 小鼠模型（SOD1G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠、FUSR521C 轉(zhuǎn)基因小鼠），探討了Nicotinamide riboside（NR）、Pterostilbene （PT）與Ibudilast（IBU）聯(lián)合使用對運動神經(jīng)元保護及小鼠存活的影響，并深入解析其作用機制。主要發(fā)現(xiàn)以下機制：ALS 病理損傷的核心機制為 “促炎細胞因子→H₂O₂/NO 生成→・OH/・OONO⁻積累→運動神經(jīng)元氧化損傷”的級聯(lián)反應。Nicotinamide riboside 通過補充 NAD ⁺ 激活抗氧化通路，Pterostilbene 通過激活 Nrf2 增強抗氧化防御，Ibudilast 通過抑制 PDE 降低 TNFα 水平，三者協(xié)同作用可阻斷氧化應激與亞硝化應激，減少神經(jīng)炎癥，保護線粒體功能，最終實現(xiàn)對運動神經(jīng)元的保護。由AbMole提供的L-NAME（NG-nitro-L-arginine methyl ester，AbMole，M2818）作為一氧化氮合酶（NOS）的特異性抑制劑，在本研究中用于驗證 NO 在 ALS 病理進程中的直接作用。通過腹腔注射 L-NAME（20 mg/kg/天，自18周起給藥至小鼠死亡），可顯著降低ALS小鼠運動神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞的 NO 生成量（NOx 水平較對照組減少 40%-50%），并降低亞硝化應激標志物（亞硝基硫醇、3-硝基酪氨酸）的水平，證明 NO 是ALS模型中促損傷的關鍵分子^[10]。

 

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圖 4. Treatment with L-NAME decreases NO generation and increases survival in ALS mice^[10].

2. Oxid Med Cell Longev. 2021 Jun 14;2021:6662225.
江蘇大學附屬醫(yī)院的實驗人員在上述文章中，探究了動脈粥樣硬化（AS）合并抗磷脂綜合征（APS）背景下，氧化低密度脂蛋白/β2糖蛋白I / 抗β2糖蛋白I抗體復合物（oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI）對血管內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)控機制，及其與內(nèi)皮細胞功能障礙的關聯(lián)。實驗人員以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和小鼠腦內(nèi)皮細胞（bEnd.3）為模型，通過 Western blot、透射電鏡（TEM）及 mRFP-GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)：oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI 復合物可以抑制內(nèi)皮細胞自噬，并且在復合物處理后，細胞的PI3K（Tyr458）、AKT（Ser473）、mTOR（Ser2448）及 eNOS（Ser1177）磷酸化水平顯著升高（峰值出現(xiàn)于處理后的30-45 分鐘），且 AKT 抑制劑 AZD5363可抑制 eNOS 磷酸化，證明eNOS是AKT的下游靶點。來自AbMole的L-NAME（N (ω)-nitro-L-arginine methyl ester，M2818）在本研究中用于驗證 eNOS 通路在復合物調(diào)控內(nèi)皮細胞自噬中的必要性，L-NAME預處理HUVECs和bEnd.3細胞（100μM，4 小時），可抑制 oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI 復合物誘導的 eNOS 磷酸化（Ser1177），從而阻斷 eNOS 通路激活^[11]。

 

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圖 5. The regulation of PI3K/AKT/mTOR and eNOS signaling pathways in oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI complex-mediated endothelial autophagy^[11].

AbMole是ChemBridge中國區(qū)官方指定合作伙伴。

 

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參考文獻及鳴謝
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[6] Monika Sharma, Pankaj Pal, FaheemHyder Pottoo, et al., Mechanistic Role of Methanolic Extract of Taraxacum officinale Roots as Cardioprotective Against Ischemia–Reperfusion Injury-Induced Myocardial Infarction in Rats, Applied Biochemistry and Biotechnology 195(5) (2023) 3384-3405.
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[11] G. Zhang, C. He, Q. Wu, et al., Impaired Autophagy Induced by oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI Complex through PI3K/AKT/mTOR and eNOS Signaling Pathways Contributes to Endothelial Cell Dysfunction, Oxidative medicine and cellular longevity 2021 (2021) 6662225.