新型寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)毫米級(jí)景深捕捉小鼠腦區(qū)細(xì)胞動(dòng)態(tài)

本論文由Hao Xie、Xiaofei Han、Guihua Xiao、Hanyun Xu、Yuanlong Zhang、Guoxun Zhang、Qingwei Li、Jing He、Dan Zhu、Xinguang Yu和Qionghai Dai共同完成，論文標(biāo)題為"Multifocal fluorescence video-rate imaging of centimetre-wide arbitrarily shaped brain surfaces at micrometric resolution"發(fā)表于《Nature Biomedical Engineering》。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與系統(tǒng)設(shè)計(jì)
MFIAS技術(shù)的核心在于結(jié)合計(jì)算機(jī)視覺和光學(xué)設(shè)計(jì)，通過主動(dòng)成像框架實(shí)現(xiàn)非平面表面的高分辨率動(dòng)態(tài)成像。系統(tǒng)首先自動(dòng)檢測(cè)表面輪廓，然后基于輪廓信息設(shè)計(jì)時(shí)空編碼照明序列，利用旋轉(zhuǎn)盤在單幀曝光時(shí)間內(nèi)完成快速軸向掃描。旋轉(zhuǎn)盤由不同厚度的玻璃組成，通過連續(xù)旋轉(zhuǎn)改變焦點(diǎn)位置，類似于物理學(xué)中的“斷鉛筆錯(cuò)覺”效應(yīng)，從而在毫米級(jí)景深內(nèi)實(shí)現(xiàn)近連續(xù)調(diào)焦。同時(shí)，數(shù)字微鏡器件（DMD）用于時(shí)空調(diào)制樣本照明，確保僅對(duì)焦區(qū)域被選擇性照亮，從而提升光子效率和減少光毒性。

系統(tǒng)工作時(shí)，旋轉(zhuǎn)盤的位置通過紅外探測(cè)器監(jiān)控，并與DMD和相機(jī)同步，確保曝光期間每個(gè)玻璃厚度對(duì)應(yīng)一個(gè)照明模式，最終圖像整合了不同深度的焦區(qū)信息。這種設(shè)計(jì)使得MFIAS能夠在保持高分辨率的同時(shí)，覆蓋厘米級(jí)視場(chǎng)，且成像速度僅受相機(jī)幀率限制，最高可達(dá)每秒50幀。

02實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與性能表征
為驗(yàn)證MFIAS性能，研究團(tuán)隊(duì)在RUSH宏觀系統(tǒng)上進(jìn)行了測(cè)試，使用0.5微米熒光微球作為樣本。實(shí)驗(yàn)表明，焦點(diǎn)移位與玻璃厚度呈線性關(guān)系，且橫向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）在全視場(chǎng)內(nèi)保持均勻，平均半高全寬（FWHM）介于1.4至1.6微米之間，不隨玻璃厚度增加而惡化。與傳統(tǒng)顯微鏡相比，高數(shù)值孔徑（NA=0.3）系統(tǒng)雖分辨率高但景深�。�約10微米），低數(shù)值孔徑（NA=0.1）系統(tǒng)景深大（約90微米）但分辨率低三倍；MFIAS則通過掃描整個(gè)軸向范圍并僅檢測(cè)焦內(nèi)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了高分辨率、大景深和高光子效率的平衡。

此外，MFIAS可靈活集成到多種宏觀系統(tǒng)中，如定制單反鏡頭系統(tǒng)（MFIAS-SLR），在7毫米視場(chǎng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)7.4微米分辨率成像。通過對(duì)小鼠大腦進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，MFIAS提供了全腦表層高分辨率圖像，而傳統(tǒng)顯微鏡僅能聚焦中央?yún)^(qū)域，證明了其在復(fù)雜曲面成像中的優(yōu)勢(shì)。

03生物應(yīng)用示例
在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用中，MFIAS被用于記錄轉(zhuǎn)基因小鼠（Rasgrf2-2A-dCre;Ai148D）大腦淺層皮質(zhì)自發(fā)活動(dòng)。該系統(tǒng)以10幀/秒速度捕獲整個(gè)皮質(zhì)神經(jīng)響應(yīng)，通過CNMF-E算法和OASIS方法提取鈣信號(hào)，結(jié)果顯示神經(jīng)元信號(hào)在全視場(chǎng)內(nèi)分布均勻，峰值信噪比（PSNR）恒定，而傳統(tǒng)顯微鏡在邊緣區(qū)域PSNR降至基線水平。MFIAS還成功檢測(cè)到視覺刺激下視覺皮層中的方向選擇性神經(jīng)元，為神經(jīng)編碼研究提供了新視角。

在免疫學(xué)方面，MFIAS實(shí)時(shí)追蹤了顱骨開窗后小鼠腦表面中性粒細(xì)胞的遷移行為。實(shí)驗(yàn)觀察到中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)流動(dòng)、黏附及組織內(nèi)遷移的多步過程，并利用TrackMate軟件分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)模式，揭示了集體遷移和聚集現(xiàn)象。這種大視場(chǎng)成像能力為炎癥反應(yīng)機(jī)制研究提供了前所未有的細(xì)節(jié)。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像局限
MFIAS技術(shù)核心創(chuàng)新在于解決了寬場(chǎng)熒光顯微鏡在曲面成像中的根本難題：傳統(tǒng)技術(shù)無法同時(shí)兼顧高分辨率、大視場(chǎng)、高速和深景深。例如，快速軸向掃描方法（如壓電平臺(tái)）受限于重量和速度；遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)增加系統(tǒng)復(fù)雜度；可調(diào)透鏡存在視場(chǎng)和速度權(quán)衡；而光場(chǎng)顯微鏡等計(jì)算方需要先驗(yàn)信息且易產(chǎn)生偽影。MFIAS通過旋轉(zhuǎn)盤和選擇性照明的簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了物理光學(xué)與計(jì)算視覺的融合，無需復(fù)雜重建即可獲得無偽影圖像。

技術(shù)亮點(diǎn)包括：首先，旋轉(zhuǎn)盤機(jī)制使系統(tǒng)每秒掃描達(dá)16.8億體素，吞吐量比單平面采集提升100倍；其次，平面光學(xué)元件在遠(yuǎn)心系統(tǒng)中平等處理全視場(chǎng)，確保高分辨率一致性；最后，主動(dòng)照明策略將光毒性降至最低，適合長(zhǎng)期活體觀測(cè)。此外，MFIAS兼容反射和熒光模式，可擴(kuò)展至植物靜脈成像或昆蟲翅膀觀察等應(yīng)用場(chǎng)景。

技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性和易用性也是亮點(diǎn)之一：系統(tǒng)基于商用組件構(gòu)建，成本較低，且可通過多盤設(shè)計(jì)（如“時(shí)-分-秒”盤組合）擴(kuò)展景深，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。這種靈活性使其在臨床診斷和基礎(chǔ)研究中具有廣泛應(yīng)用潛力。

總結(jié)與展望
MFIAS宏觀成像技術(shù)通過創(chuàng)新性的旋轉(zhuǎn)盤設(shè)計(jì)和選擇性照明策略，成功打破了傳統(tǒng)光學(xué)成像的壁壘，實(shí)現(xiàn)了對(duì)任意形狀表面的高速、高分辨率觀測(cè)。在活體小鼠腦實(shí)驗(yàn)中，該技術(shù)不僅揭示了神經(jīng)活動(dòng)和免疫細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié)，還展示了其在多學(xué)科交叉研究中的通用性。盡管目前系統(tǒng)在穿透深度和表面檢測(cè)速度上存在局限，但通過集成光學(xué)切片算法和硬件加速，未來有望實(shí)現(xiàn)對(duì)更復(fù)雜生物過程的縱深探索。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化，MFIAS或?qū)⒊蔀樯�命科學(xué)領(lǐng)域不可或缺的成像平臺(tái)，為神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)乃至臨床診斷開辟新路徑。