多光子光聲顯微鏡對腦細(xì)胞內(nèi)源性輔酶NAD(P)H的高分辨率深度成像

本論文的重要發(fā)現(xiàn)者為Tatsuya Osaki、W. David Lee、Xiang Zhang、Rebecca E. Zubajlo、Mercedes Balcells-Camps、Elazer R. Edelman、Brian W. Anthony、Mriganka Sur和Peter T. C. So，論文標(biāo)題為“Multi-photon, label-free photoacoustic and optical imaging of NADH in brain cells”，于2025年發(fā)表在《Light: Science & Applications》期刊。

重要發(fā)現(xiàn)
01成像系統(tǒng)開發(fā)與原理
本研究核心是開發(fā)了一套新型無標(biāo)記多光子光聲顯微鏡系統(tǒng)（LF-MP-PAM），該系統(tǒng)整合了近紅外飛秒激光（波長1300納米）和聲學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了光學(xué)激發(fā)與聲學(xué)檢測的協(xié)同作用。系統(tǒng)采用三光子激發(fā)機(jī)制，針對NAD(P)H的低量子產(chǎn)率特性，通過熱膨脹產(chǎn)生聲波信號，再利用超聲傳感器捕獲這些信號進(jìn)行成像。與傳統(tǒng)光學(xué)成像相比，聲波在生物組織中散射較小，從而顯著提升了穿透深度。系統(tǒng)關(guān)鍵組件包括非共線光學(xué)參量放大器（NOPA）、galvo-galvo掃描器和定制聲學(xué)傳感器，確保了單細(xì)胞級分辨率（橫向約2.2微米，軸向約30微米）。通過K-Wave模擬，預(yù)測了聲波頻率在90-125兆赫茲范圍內(nèi)，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。

隨后，在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，團(tuán)隊(duì)將HEK293T和HepG2細(xì)胞與NADH溶液孵育30分鐘，利用光聲顯微鏡監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)NAD(P)H水平變化。結(jié)果顯示，孵育后光聲信號顯著增強(qiáng)5倍，同時通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡使用NAD(P)H傳感器獨(dú)立驗(yàn)證了NADH攝取增加，排除了其他色素（如FAD或膠原蛋白）的干擾，確認(rèn)信號主要源自NAD(P)H。

關(guān)鍵突破體現(xiàn)在深度成像能力上：在1毫米厚腦切片中，光聲信號在700微米深度仍保持高信噪比，衰減曲線符合組織吸收散射模型；在人類iPS細(xì)胞衍生的腦類器官中，成像深度進(jìn)一步達(dá)到1100微米，而光學(xué)信號在400微米深度即衰減至噪聲水平。此外，類器官培養(yǎng)時間（從21天到90天）與NADH水平增加相關(guān)，凸顯了該技術(shù)在監(jiān)測組織發(fā)育中的應(yīng)用潛力。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像深度限制
本研究的核心創(chuàng)新在于解決了長期困擾生物成像領(lǐng)域的深度難題。傳統(tǒng)全光學(xué)成像方法受限于組織對紫外熒光的強(qiáng)烈吸收，在腦組織中的有效深度僅為100-200微米，而光聲成像通過聲學(xué)檢測避開了光學(xué)散射，將深度提升至700微米（腦切片）和1100微米（類器官），相當(dāng)于傳統(tǒng)方法的6倍以上。這種突破得益于多光子激發(fā)與聲學(xué)傳輸?shù)膮f(xié)同：近紅外激光（1300納米）減少了組織衰減，同時低量子產(chǎn)率的NAD(P)H在激發(fā)時產(chǎn)生大量熱能，轉(zhuǎn)化為可檢測的聲波。與磷磁共振波譜（P-MRS）等深度技術(shù)相比，本方法保持了單細(xì)胞分辨率，填補(bǔ)了深層組織無標(biāo)記代謝成像的空白。

02新技術(shù)融合與多模態(tài)成像
LF-MP-PAM系統(tǒng)首次將三光子光聲成像應(yīng)用于NAD(P)H檢測，實(shí)現(xiàn)了多模態(tài)集成。系統(tǒng)同時捕獲光學(xué)（如熒光、THG）和光聲信號，允許實(shí)時對比驗(yàn)證，增強(qiáng)了數(shù)據(jù)的可靠性。例如，在腦切片中，NADH光學(xué)信號與神經(jīng)元鈣活動動態(tài)相關(guān)，而光聲信號則提供了深度信息。這種多模態(tài)能力不僅提升了成像的豐富度，還為研究代謝與電活動的關(guān)聯(lián)提供了新途徑。技術(shù)上，系統(tǒng)采用定制聲學(xué)傳感器和實(shí)時處理管道，確保了高幀率（如0.76幀/秒）和高靈敏度，為活體應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

03在生物醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用價值
這項(xiàng)技術(shù)的光學(xué)生物醫(yī)療價值顯著，尤其適用于神經(jīng)科學(xué)和疾病模型研究。NAD(P)H作為代謝標(biāo)志物，與神經(jīng)元活動、癲癇、阿爾茨海默病等密切相關(guān)，本方法使得在深層組織中實(shí)時監(jiān)測代謝變化成為可能。例如，在腦類器官中成功監(jiān)測到發(fā)育相關(guān)的NADH增加，證明了其在模擬人類腦疾病中的潛力。未來，該技術(shù)可擴(kuò)展至其他器官類器官（如肝、腎）或結(jié)合基因編碼傳感器（如GCaMP），用于個性化醫(yī)療和藥物篩選。此外，無標(biāo)記特性避免了熒光標(biāo)記的侵入性，更貼近臨床轉(zhuǎn)化需求。

總結(jié)與展望
本研究通過開發(fā)LF-MP-PAM系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了對NAD(P)H的無標(biāo)記、深度成像，突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像的深度限制，為腦代謝研究提供了強(qiáng)大工具。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證從凝膠模型到活細(xì)胞、腦切片和類器官，系統(tǒng)性強(qiáng)，結(jié)論可靠。技術(shù)亮點(diǎn)在于多光子光聲融合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分辨率下的毫米級穿透，兼具高靈敏度和實(shí)時性。

展望未來，該系統(tǒng)有望推動神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的變革，例如在活體動物或人類大腦中監(jiān)測神經(jīng)元活動，或應(yīng)用于疾病早期診斷。盡管當(dāng)前系統(tǒng)仍需優(yōu)化（如提升分辨率、實(shí)現(xiàn)同側(cè)成像），但其潛力巨大，結(jié)合人工智能和臨床設(shè)備，或?qū)⒊蔀橄乱淮�生物成像技術(shù)的標(biāo)桿。總之，這項(xiàng)工作不僅解決了成像難題，更開啟了代謝動力學(xué)研究的新篇章。

DOI:10.1038/s41377-025-01895-x.