從原核到真核全面解析潮霉素B(Hygromycin B)在細胞抗性篩選中的應(yīng)用

Hygromycin B（潮霉素 B）是一種由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，具有廣譜的蛋白合成抑制活性，廣泛應(yīng)用于分子生物學和細胞工程領(lǐng)域。其作用機制主要通過干擾核糖體的易位過程，從而抑制原核及真核生物中的蛋白翻譯。由于其可被抗性基因（如hph）編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶失活，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）已成為基因工程研究中重要的篩選工具，尤其在構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株、轉(zhuǎn)基因動物模型及植物遺傳轉(zhuǎn)化等研究中具有重要應(yīng)用。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。

一、Hygromycin B（潮霉素 B）的作用機理
Hygromycin B（潮霉素 B，AbMole，M2761）可通過結(jié)合核糖體 A位點，增強tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻斷肽鏈延伸過程中的易位，抑制蛋白質(zhì)合成。此外，Hygromycin B還可誘導(dǎo)mRNA的錯讀，進一步干擾翻譯過程。Hygromycin B在細菌、酵母、植物細胞和哺乳動物細胞中均表現(xiàn)出抑制活性[1, 2]。

二、Hygromycin B（潮霉素 B）的科研應(yīng)用
1. Hygromycin B（潮霉素 B）在原核細胞抗性篩選中的應(yīng)用
Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）可用于原核系統(tǒng)的篩選。hph 和 aphIV是常用的Hygromycin B的抗性基因。hph基因，即潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，可以對Hygromycin B進行磷酸化修飾，使其失去核糖體結(jié)合能力。實驗人員可以利用DNA重組技術(shù)將外源基因整合到含有hph 或 aphIV的質(zhì)粒載體上，當該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進入細菌（如大腸桿菌）后，通過在生長培養(yǎng)基中加入適當濃度的Hygromycin B，可以有效地抑制不含有該質(zhì)粒的菌落生長。這使得研究人員能夠高效地篩選出成功轉(zhuǎn)化了目標質(zhì)粒的菌株，用于后續(xù)實驗。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

圖 1. 帶有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體

2. Hygromycin B（潮霉素 B）在構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中的應(yīng)用
Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）是篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的強有力工具。將潮霉素抗性基因（hph）與目的基因共同構(gòu)建于同一質(zhì)粒載體上，并將其導(dǎo)入哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞中。之后使用含Hygromycin B（潮霉素 B，AbMole，M2761）的培養(yǎng)液進行長期篩選。未成功整合外源基因及抗性基因的細胞因缺乏保護機制，其蛋白質(zhì)合成被抑制而死亡；而成功整合了抗性基因的細胞則能夠存活并增殖，最終形成穩(wěn)定的細胞系。潮霉素 B已成為研究細胞功能、基因過表達、RNA干擾等實驗的常用抗生素。此外，在一些復(fù)雜的實驗設(shè)計中，研究人員常利用多種抗性基因進行多重篩選。例如，將潮霉素與G418聯(lián)合使用，可以篩選同時表達兩個獨立外源基因的細胞株，這對于研究蛋白相互作用或協(xié)同效應(yīng)至關(guān)重要[3]。

3. Hygromycin B（Hygrovetine）在轉(zhuǎn)基因動物與植物模型開發(fā)中的應(yīng)用
在模式生物的開發(fā)中，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）同樣扮演了關(guān)鍵角色。在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠、線蟲（如C. elegans）或其他模式生物時，hph基因可作為有效的遺傳篩選標記。通過顯微注射或其他方法將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)基因元件導(dǎo)入受精卵細胞后，在后續(xù)的培養(yǎng)或篩選中加入Hygromycin B，可以方便快捷地鑒定出成功整合了外源基因的細胞，大大提高了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的效率。在植物生物學領(lǐng)域，Hygromycin B被廣泛用于篩選轉(zhuǎn)化后的植物細胞和組織。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍法轉(zhuǎn)化后，植物組織在含Hygromycin B的培養(yǎng)基上生長，只有成功表達了hph基因的細胞才能發(fā)育成完整的抗性幼苗，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。這對于作物基因功能研究和育種工作具有重要意義。

三、范例詳解
J Med Chem. 2023 Dec;17138–17154.
蘭州大學、徐州醫(yī)科大學的研究團隊在上述文章中以先前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽 FF受體多功能激動劑 DN-9 為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成了7種訂書肽（Stapled Peptides）類似物，并通過多維度實驗評估它們的活性，最終篩選出最優(yōu)候選活性分子。實驗人員以 DN-9為母肽，通過引入α-烯基氨基酸并進行關(guān)環(huán)復(fù)分解（RCM）反應(yīng)合成 7 種全烴訂書肽。在體外實驗中，科研人員通過鈣動員實驗評估訂書肽對 MOPr、κ-阿片受體（KOPr）、δ- 阿片受體（DOPr）及NPFF₁R、NPFF₂R的激動活性；在小鼠血漿和腦勻漿中測定代謝穩(wěn)定性，計算降解半衰期。在體內(nèi)實驗中，科研人員采用甩尾實驗評估皮下（s.c）、腦室內(nèi)（i.c.v.）和口服（p.o）給藥后的鎮(zhèn)痛活性及持續(xù)時間；通過藥理學實驗（如使用受體拮抗劑）明確鎮(zhèn)痛作用機制；借助旋轉(zhuǎn)桿實驗、胃腸道轉(zhuǎn)運（GIT）實驗、條件性位置偏愛（CPP）實驗、納洛酮誘發(fā)戒斷實驗及全身體積描記法，評估運動損傷、便秘、成癮性和呼吸抑制等副作用；通過藥代動力學研究（LC-MS/MS）分析最優(yōu)化合物的血腦屏障穿透能力。研究人員在進行體外鈣動員實驗時，為了篩選穩(wěn)定表達阿片受體及神經(jīng)肽FF受體的CHO細胞，使用了由AbMole提供的Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761），篩選濃度為100 μg/mL[4]。

圖 2. 7種訂書肽的體內(nèi)實驗結(jié)果[4]

參考文獻及鳴謝
[1] Linda Gritz, Julian %J Gene Davies, Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, 25(2-3) (1983) 179-188.
[2] M Dutt, JW %J Plant cell reports Grosser, An embryogenic suspension cell culture system for Agrobacterium-mediated transformation of citrus, 29(11) (2010) 1251-1260.
[3] Robert F Santerre, Jenna D Walls, Brian W Grinnell, Use of vectors to confer resistance to antibiotics G418 and hygromycin in stably transfected cell lines, Gene Transfer and Expression Protocols, Springer1991, pp. 245-256.
[4] M. Zhang, B. Xu, N. Li, et al., All-Hydrocarbon Stapled Peptide Multifunctional Agonists at Opioid and Neuropeptide FF Receptors: Highly Potent, Long-Lasting Brain Permeant Analgesics with Diminished Side Effects, J Med Chem 66(24) (2023) 17138-17154.