CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的調(diào)控機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌獲得性免疫的重要組成部分，由Cas核酸酶和兩種單獨(dú)的RNA成分組成，即可編程crRNA（CRISPR RNA）和固定的TracRNA（反式激活crRNA）。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier發(fā)現(xiàn)Cas9可以當(dāng)作DNA切割工具，CRISPR/Cas9技術(shù)才真正開始受到廣泛關(guān)注。

CRISPR/Cas9調(diào)控機(jī)制
1、CRISPR的轉(zhuǎn)錄：CRISPR被轉(zhuǎn)錄成一條長(zhǎng)RNA(pre-crRNA)，包含了重復(fù)序列和間隔序列。
2、tracrRNA的轉(zhuǎn)錄：tracrRNA轉(zhuǎn)錄成tracrRNA。
3、CRISPR/Cas9復(fù)合物的成熟：tracrRNA與pre-crRNA結(jié)合，經(jīng)過(guò)外源RNase III的剪切，Cas9也參與crRNA成熟。tracrRNA與crRNA融合即sgRNA，并與Cas9結(jié)合。
4、靶標(biāo)識(shí)別：CRISPR/Cas9復(fù)合物掃描入侵的DNA，尋找與crRNA間隔序列互補(bǔ)的序列。識(shí)別過(guò)程中，crRNA的間隔序列與目標(biāo)DNA（即gRNA）的特定序列（原間隔短回文重復(fù)序列鄰近基序，PAM）配對(duì)。
5、DNA切割：一旦找到匹配的序列，核酸酶Cas9就在PAM位點(diǎn)附近切割DNA雙鏈。核酸酶Cas9有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，HNH結(jié)構(gòu)域切割DNA的一條鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域切割另一條鏈。
6、DNA修復(fù)：細(xì)菌或細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)機(jī)制修復(fù)DNA斷裂。NHEJ通常會(huì)導(dǎo)致插入或缺失(indels)，而HDR可以精確修復(fù)DNA，如果提供了修復(fù)模板的話。

注：CRISPR/Cas9系統(tǒng)的調(diào)控：在自然狀態(tài)下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的激活是被動(dòng)的，一旦crRNA與Cas9結(jié)合，系統(tǒng)就處于待激活狀態(tài)�？梢酝ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)特定的gRNA來(lái)調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使其靶向特定的基因序列。

圖1 CRISPR/Cas9調(diào)控[1]

圖2 CRISPR/Cas9剪切后的DNA修復(fù)[1]

CRISPR/Cas9的基因調(diào)控
CRISPR/Cas-9介導(dǎo)的基因組編輯已成為治療開發(fā)和生物醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)潛在的創(chuàng)新技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)由于其靈活性、簡(jiǎn)單性、高效性和精確基因組編輯的多重性而為疾病治療帶來(lái)了巨大的希望。

1、GM-CSF：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GM-CSF敲除，并與野生型CAR T細(xì)胞相比，GM-CSF^k/oCAR T細(xì)胞產(chǎn)生較少的GM-CSF而不減弱體內(nèi)抗腫瘤活性[2]。

圖3 A: 在野生型CART19和GM-CSF^k/o CART19上具有相似CAR表達(dá)的成功CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)。
B: 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色檢測(cè)，在用CD19陽(yáng)性ALL細(xì)胞系NALM6刺激時(shí)，與野生型CART19相比，GM-CSF^k/o CART19細(xì)胞顯示出減少的GM-CSF

2、Frizzled 7：在腦內(nèi)出血(ICH)誘導(dǎo)前48h，通過(guò)腦室內(nèi)注射成簇規(guī)則間隔回文重復(fù)序列(CRISPR)進(jìn)行Frizzled 7激活或敲低。結(jié)果表明激活Frizzled-7可顯著增加Dvl、β-Catenin、WISP1、VE-Cadherin、Claudin-5、ZO-1的表達(dá)，并降低磷酸-β-Catenin的表達(dá)。在ICH后24h，WISP1基因敲除可消除Frizzled 7激活對(duì)VE-Cadherin、Claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響。因此，F(xiàn)rizzled 7可能是ICH患者BBB保護(hù)和改善預(yù)后的潛在治療靶點(diǎn)[3]。

相關(guān)產(chǎn)品：

參考文獻(xiàn)：
[1] Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017 May 22;46:505-529. doi: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822. Epub 2017 Mar 30. PMID: 28375731.
[2] Sterner RM, Cox MJ, Sakemura R, Kenderian SS. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J Vis Exp. 2019 Jul 22;(149). doi: 10.3791/59629. PMID: 31380838.
[3] He W, Lu Q, Sherchan P, Huang L, Hu X, Zhang JH, Dai H, Tang J. Activation of Frizzled-7 attenuates blood-brain barrier disruption through Dvl/β-catenin/WISP1 signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. Fluids Barriers CNS. 2021 Sep 26;18(1):44. doi: 10.1186/s12987-021-00278-9. PMID: 34565396.