多光子活體實時成像技術用于解析中樞神經(jīng)系統(tǒng)邊界結構
本研究由Pauline Hélie-Legoupil、Florencia Kloster等共同主導的論文《In vivo imaging of the barrier properties of the glia limitans during health and neuroinflammation》于2025年10月在《Nature Communications》期刊正式發(fā)表。
重要發(fā)現(xiàn)
01膠質界膜報告小鼠的構建與驗證
基因編輯策略與蛋白定位
研究團隊基于AQP4在星形膠質細胞腳板高度極性化表達的特性，將mRuby3序列插入Aqp4基因 exon 2的Val141和Val142之間，構建了AQP4-mRuby3融合蛋白。該設計采用GGGS重復序列作為柔性連接肽，確保熒光蛋白正確折疊且不影響AQP4形成四聚體或更高級的OAPs結構。通過免疫熒光共定位實驗，在腦皮質和脊髓的血管周星形膠質細胞腳板及表面膠質界膜中均驗證了融合蛋白與內源性AQP4的共定位。
生理功能完整性評估
為評估報告基因對水通道功能的影響，團隊比較了野生型、雜合子和純合子小鼠腦組織含水量。發(fā)現(xiàn)純合子小鼠腦含水量輕微增加，而雜合子小鼠與野生型無顯著差異。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，雜合子小鼠的發(fā)病進程、脊髓含水量及脾細胞增殖反應均未受影響，證明AQP4-mRuby3融合蛋白不影響神經(jīng)炎癥進程。電鏡分析進一步顯示雜合子小鼠星形膠質細胞腳板超微結構正常，三類形態(tài)學評分（正常、輕度腫脹、明顯腫脹）與野生型無統(tǒng)計學差異。
02多光子活體成像技術的突破
雙光子激發(fā)波長優(yōu)化
研究采用1045 nm激發(fā)波長可高效激發(fā)mRuby3信號，同時產(chǎn)生膠原纖維的二次諧波信號（SHG）。通過顱窗、薄化顱骨和脊髓窗手術制備，實現(xiàn)了對大腦皮質表面和脊髓膠質界膜的三維動態(tài)觀測。表面膠質界膜的AQP4-mRuby3信號呈彌散分布，而血管周膠質界膜則呈現(xiàn)高度極化的亮信號，這與星形膠質細胞形態(tài)差異相符。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)邊界報告系統(tǒng)
將Aqp4-mRuby3小鼠與VE-cadherin-GFP小鼠雜交，構建了可同步顯示膠質界膜、血管內皮和軟腦膜邊界的報告系統(tǒng)。采用雙波長激發(fā)（920 nm和1045 nm）策略，解決了不同熒光蛋白最佳激發(fā)譜差異的難題。該模型清晰展示了血管深入實質時膠質界膜從表面到血管周的漏斗狀過渡結構，為界定血管周空間提供了精確標志。
大分子示蹤劑動態(tài)監(jiān)測
通過小腦延髓池注射10 kDa FITC-葡聚糖和1 μm PEG化熒光微球，發(fā)現(xiàn)兩者均被限制在蛛網(wǎng)膜下腔，2小時內未穿過膠質界膜進入實質。定量分析顯示蛛網(wǎng)膜下腔熒光強度顯著高于實質區(qū)，證實膠質界膜對可溶性分子和顆粒性物質的屏障作用。
免疫細胞行為追蹤
在CX3CR1-GFP/Aqp4-mRuby3雙報告小鼠中，根據(jù)細胞與膠質界膜的相對位置可清晰區(qū)分邊界相關巨噬細胞（位于界膜上方）與小膠質細胞（位于界膜下方）。表面膠質界膜上的BAMs呈阿米巴樣形態(tài)，而實質內小膠質細胞則呈現(xiàn)高度動態(tài)的細長突起。
CD4+ T細胞跨屏障行為
在EAE模型中，通過GFP標記的2D2 CD4+ T細胞動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)，T細胞在血管腔、蛛網(wǎng)膜下腔、軟膜下間隙和實質內的遷移行為存在顯著差異。實質內T細胞移動速度更快、方向性更強，提示其沿白質束遷移的特性。統(tǒng)計顯示疾病高峰期T細胞主要積聚于蛛網(wǎng)膜下腔和實質內，硬腦膜區(qū)數(shù)量最少。
CD8+ T細胞監(jiān)視與侵襲模式
在ODC-OVA小鼠模型中，OVA特異性CD8+ T細胞在免疫監(jiān)視狀態(tài)下主要停留于邊界區(qū)，而抗原識別后則大量穿越膠質界膜進入實質。軌跡分析顯示實質內T細胞位移距離和運動速度顯著高于邊界區(qū)細胞，且在神經(jīng)炎癥狀態(tài)下整體運動性下降。
創(chuàng)新與亮點
01技術突破：首例膠質界膜在體成像模型
本研究首創(chuàng)的Aqp4-mRuby3報告小鼠解決了長期以來無法直接觀測膠質界膜動態(tài)的難題。通過精準的基因編輯設計，將熒光蛋白插入AQP4第二胞外環(huán)，既保留了蛋白功能又實現(xiàn)了高信噪比標記。相較于傳統(tǒng)免疫組化或體外培養(yǎng)模型，該技術首次實現(xiàn)了在生理條件下對膠質界膜屏障功能的連續(xù)觀測。
研究建立了整合血管、腦膜和膠質界膜標記的中樞神經(jīng)系統(tǒng)邊界報告系統(tǒng)。通過優(yōu)化雙光子激發(fā)波長組合和圖像采集時序，實現(xiàn)了不同細胞成分的同步動態(tài)追蹤。特別是針對脊髓頸段窗口的成像方案，為研究免疫細胞在神經(jīng)炎癥中的遷移途徑提供了獨特視角。
03科學價值：重新定義中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫分區(qū)
本研究通過直接證據(jù)確立了膠質界膜作為實質性屏障的關鍵地位，推動了"城堡護城河"理論的發(fā)展。發(fā)現(xiàn)膠質界膜不僅阻擋免疫細胞入侵，還主動參與調控免疫細胞運動模式。對類淋巴系統(tǒng)假說提出挑戰(zhàn)，證實大分子物質無法通過血管周途徑自由進入實質。
總結與展望
Aqp4-mRuby3報告小鼠模型的成功開發(fā)為神經(jīng)免疫研究領域提供了強大工具，使科學家首次能夠在活體動物中直觀觀察膠質界膜的動態(tài)屏障功能。該技術不僅證實了膠質界膜在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫特權中的關鍵作用，還揭示了免疫細胞穿越不同邊界區(qū)的分子機制差異。未來這一模型可進一步與疾病模型小鼠結合，用于研究多發(fā)性硬化、腦水腫、神經(jīng)退行性疾病等病理過程中膠質界膜的功能演變。此外，該技術平臺為篩選靶向膠質界膜的藥物提供了新型評估手段，有望推動神經(jīng)免疫疾病治療策略的創(chuàng)新發(fā)展。隨著精準基因編輯技術的進步，未來或可開發(fā)出能夠實時反映膠質界膜通透性變化的智能報告系統(tǒng)，為最終揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調控的奧秘開辟新途徑。
聲明：本文僅用作學術目的。
Hélie-Legoupil P, Kloster F, Pareja J, Vladymyrov M, Mapunda JA, Bouillet E, Oetiker Y, Spera I, Barcos S, Brenna A, Odriozola A, Baert A, Fankhauser C, Haenni B, Proulx ST, Zuber B, Deutsch U, Engelhardt B. In vivo imaging of the barrier properties of the glia limitans during health and neuroinflammation. Nat Commun. 2025 Oct 7;16(1):8895.
DOI:10.1038/s41467-025-63945-7.
