4.9微米空間分辨率寬場熒光顯微鏡用于定位追蹤小鼠腦皮層血管成像

本研究的核心貢獻(xiàn)者包括Quanyu Zhou、Claim Glück、Lin Tang、Lukas Glandorf、Jeanne Droux、Mohamad El Amki、Susanne Wegener、Bruno Weber、Daniel Razansky和Zhenyue Chen。他們的合作成果以題為“Cortex-wide transcranial localization microscopy with fluorescently labeled red blood cells”的論文形式，在《Nature Communications》期刊上在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與系統(tǒng)設(shè)計
本研究的核心是紅細(xì)胞輔助的寬場熒光定位顯微鏡技術(shù)，其基礎(chǔ)在于利用寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)對稀疏標(biāo)記的熒光紅細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)定位和跟蹤。系統(tǒng)采用典型的epi-熒光配置，集成660納米和488納米兩個連續(xù)波激光源作為激發(fā)光源，分別用于DiD標(biāo)記的紅細(xì)胞和GCaMP鈣指示劑的成像。檢測部分則配備高速sCMOS相機(jī)，幀率最高可達(dá)833赫茲，確保能夠捕獲快速血流動態(tài)。光學(xué)路徑中通過二向色鏡分離激發(fā)和發(fā)射光，并結(jié)合帶通濾光片優(yōu)化信號采集。這種設(shè)計使得系統(tǒng)能夠在橫向視野覆蓋整個小鼠皮層的同時，保持微米級空間分辨率和亞秒級時間分辨率。

紅細(xì)胞標(biāo)記過程采用DiD熒光染料，通過離體染色和純化，確保標(biāo)記細(xì)胞在血液循環(huán)中保持長壽命（可達(dá)數(shù)十分鐘）。注入小鼠體內(nèi)后，稀疏的紅細(xì)胞分布使得系統(tǒng)能夠通過定位算法逐個追蹤細(xì)胞運(yùn)動。成像重建過程包括三個關(guān)鍵步驟：首先利用小波濾波和高斯擬合進(jìn)行發(fā)射體定位，獲取亞像素精度的位置信息；然后應(yīng)用u-track算法跟蹤紅細(xì)胞軌跡，計算血流速度和方向；最后通過疊加軌跡生成高分辨率血管結(jié)構(gòu)圖和功能參數(shù)圖。實驗驗證表明，該系統(tǒng)能夠區(qū)分間隔僅4.9微米的相鄰血管，并探測到大腦表面下200微米深處的血管，證實了其卓越的成像深度和分辨率。

02實驗過程與成像應(yīng)用
在功能成像實驗中，研究團(tuán)隊對麻醉小鼠施加后爪或胡須電刺激，以激發(fā)神經(jīng)血管響應(yīng)。成像序列以400赫茲幀率記錄，通過定位重建生成有效幀率為1赫茲的功能圖。例如，在后爪刺激實驗中，系統(tǒng)成功渲染了皮層血管的超分辨結(jié)構(gòu)圖，并通過計算血流時間序列與刺激模式的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，生成了血流速度激活圖。這些圖像清晰顯示了刺激引發(fā)的血流增加區(qū)域，且激活強(qiáng)度在毛細(xì)血管中高于動脈和靜脈，表明微循環(huán)在功能亢進(jìn)中起關(guān)鍵作用。

同時，通過集成488納米通道的GCaMP鈣成像，系統(tǒng)實現(xiàn)了神經(jīng)活動與血流動力學(xué)的同步記錄。在Thy1-GCaMP6f轉(zhuǎn)基因小鼠中，刺激后GCaMP激活圖與血流速度激活圖顯示出空間共定位，證實了神經(jīng)血管耦合的存在。定量分析顯示，位于神經(jīng)激活區(qū)域內(nèi)的血管段血流增加幅度（7.5±1.0%）顯著高于區(qū)域外（3.5±0.6%），且血流響應(yīng)沿血管樹從高階分支向低階分支傳遞時，激活強(qiáng)度遞增而響應(yīng)時間遞減。這一發(fā)現(xiàn)提示血流調(diào)控可能源于高階血管的主動調(diào)節(jié)。

在跨顱成像實驗中，系統(tǒng)通過調(diào)整放大倍率至0.86，實現(xiàn)了整個皮層的覆蓋。盡管顱骨引入的光子散射降低了信噪比，但技術(shù)仍能檢測到直徑小至15微米的血管激活。雙側(cè)后爪刺激實驗揭示了大腦偏側(cè)化響應(yīng)：刺激對側(cè)半球的血流變化更顯著，尤其是靜脈的激活強(qiáng)度（7.9±1.6%）高于同側(cè)（3.8±0.6%），而動脈響應(yīng)則相對均衡。這展示了技術(shù)在研究大腦半球間差異方面的潛力。

創(chuàng)新與亮點
01突破現(xiàn)有成像難題
本研究突破了傳統(tǒng)神經(jīng)成像技術(shù)的多個瓶頸。例如，雙光子顯微鏡雖能提供細(xì)胞級分辨率，但視野狹窄（通常小于1毫米）且掃描速度慢，難以實時追蹤全皮層血流；功能磁共振成像雖具非侵入性，但空間分辨率低且無法直接測量血流參數(shù)。紅細(xì)胞輔助的WFLM技術(shù)成功融合了大視野、高分辨率和快速成像的優(yōu)勢，首次實現(xiàn)了在毛細(xì)血管水平進(jìn)行皮層范圍的功能性血管成像，解決了神經(jīng)血管耦合研究中時空特征不明確的難題。

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)的紅細(xì)胞輔助寬場熒光定位顯微鏡技術(shù)，為大腦微循環(huán)成像設(shè)立了新標(biāo)準(zhǔn)。通過實現(xiàn)皮層范圍的高分辨率神經(jīng)血管同步記錄，技術(shù)不僅增進(jìn)了對神經(jīng)血管耦合的理解，還展示了在感覺刺激下血流動態(tài)的精細(xì)調(diào)控。創(chuàng)新性地利用紅細(xì)胞作為天然示蹤劑，確保了成像的生理相關(guān)性和長時間穩(wěn)定性。展望未來，該技術(shù)可通過多視角檢測策略增加三維信息，或整合功能磁共振成像等模態(tài)，進(jìn)一步解密血流參數(shù)對氧合信號的影響。此外，在疾病模型中應(yīng)用該技術(shù)，有望揭示微循環(huán)功能障礙的新機(jī)制，推動腦疾病診療策略的發(fā)展。總體而言，這項技術(shù)將成為神經(jīng)科學(xué)工具箱中的重要組成部分，為解密大腦奧秘提供強(qiáng)大支持。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Zhou Q, Glück C, Tang L, Glandorf L, Droux J, El Amki M, Wegener S, Weber B, Razansky D, Chen Z. Cortex-wide transcranial localization microscopy with fluorescently labeled red blood cells. Nat Commun. 2024 Apr 25;15(1):3526. 

DOI:10.1038/s41467-024-47892-3.