重組R-spondin 3的作用機(jī)理及在類器官構(gòu)建與干細(xì)胞調(diào)控中的應(yīng)用

重組R-spondin 3（Recombinant RSPO3）是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的分泌型糖蛋白。重組R-spondin-3（AbMole，M22488）作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑，在干細(xì)胞生物學(xué)、類器官、細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有核心價(jià)值。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫(kù)、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。

一、重組R-spondin-3（RSPO3）的作用機(jī)理
R-spondin 3（重組RSPO3，AbMole，M22488）是WNT通路的重要調(diào)節(jié)劑，RSPO3并非直接激活WNT通路，而是充當(dāng)信號(hào)的“放大器”：R-spondin-3可以通過增加WNT信號(hào)通路的核心受體——Frizzled (FZD) 和共受體LRP5/6的數(shù)量，增強(qiáng)WNT信號(hào)的傳遞。其機(jī)制是：首先，細(xì)胞內(nèi)天然存在著WNT通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子——ZNRF3和RNF43，在細(xì)胞未接收R-spondin-3信號(hào)時(shí)，它們可持續(xù)為FZD和LRP5/6添加泛素化標(biāo)記，導(dǎo)致上述兩種WNT受體被細(xì)胞內(nèi)化并降解，削弱了細(xì)胞對(duì)WNT配體的響應(yīng)能力；當(dāng)R-spondin-3（RSPO3）與細(xì)胞膜上的FZD和LRP5/6形成三元復(fù)合物后，隨即開始募集ZNRF3和RNF43，由于RSPO3的結(jié)合直接阻礙了ZNRF3/RNF43的酶活性中心，使其無法對(duì)FZD和LRP5/6受體進(jìn)行泛素化修飾。通過上述過程，RSPO3可有效提高細(xì)胞膜上的WNT受體的數(shù)量^[1]。
 
二、重組R-spondin-3（RSPO3）的研究應(yīng)用
1. R-spondin-3（RSPO3）用于干細(xì)胞和類器官的培養(yǎng)
重組R-spondin-3（AbMole，M22488）是建立和維持多種類器官長(zhǎng)期培養(yǎng)不可或缺的細(xì)胞因子。其核心功能在于模擬體內(nèi)干細(xì)胞的微環(huán)境信號(hào)，支持類器官細(xì)胞的自我更新和增殖。RSPO3 與RSPO1（重組R-spondin-1蛋白，AbMole，M15009）、RSPO2（重組R-spondin-2蛋白，AbMole，M31138）、EGF（重組EGF蛋白，AbMole，M9415）、Noggin（重組Noggin蛋白，AbMole，M9999）組合是培養(yǎng)腸類器官(Intestinal Organoids)的經(jīng)典方案。RSPO1至RSPO4對(duì)于Lgr5⁺腸道干細(xì)胞的存活和增殖都至關(guān)重要，可以驅(qū)動(dòng)隱窩形成。其中RSPO3極大增強(qiáng)了基底水平的WNT信號(hào)，為腸道類器官中的干細(xì)胞維持提供了必要條件^[2]。移除RSPO3通常導(dǎo)致干細(xì)胞分化加速和類器官解體^[2]。最近也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)R-spondin-3可通過非WNT通路促進(jìn)乳腺癌類器官的增殖和成型^[3]。RSPO3在胃類器官的研究中的作用具有區(qū)域特異性：RSPO3 在胃底（Corpus）類器官中通過激活Wnt信號(hào)促進(jìn)壁細(xì)胞的分化，而在胃竇（Antrum）類器官中，其更傾向于維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。這種差異可能與不同區(qū)域上皮細(xì)胞中LGR受體的表達(dá)譜有關(guān)，這為解析胃組織區(qū)域特異性分化機(jī)制提供了模型基礎(chǔ)^[4]。對(duì)于包含多種細(xì)胞類型的復(fù)雜類器官（如肝類器官、腎類器官），RSPO3（R-spondin-3）的作用體現(xiàn)在協(xié)調(diào)細(xì)胞間的相互作用。在肝類器官培養(yǎng)中，RSPO3 可促進(jìn)肝祖細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的共分化，增強(qiáng)類器官內(nèi)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)提高白蛋白分泌等肝功能指標(biāo)。研究表明在原代肝祖細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，添加重組RSPO3（500 ng/mL）可顯著促進(jìn)肝祖細(xì)胞（HNF4α⁺）與內(nèi)皮細(xì)胞（CD31⁺）的分化，并形成可灌注的血管樣網(wǎng)絡(luò)。R-spondin-3還能用于肝類器官的構(gòu)建。經(jīng)RSPO3處理的肝類器官，其白蛋白（ALB）分泌量提高 2.3 倍，尿素合成與CYP450代謝活性同步增強(qiáng)，提示肝類器官初步具有類似肝臟的功能^[5]。在腎類器官中，RSPO3與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）的協(xié)同作用可顯著提升腎小球樣結(jié)構(gòu)的形成效率：在腎類器官的培養(yǎng)體系中，聯(lián)合使用重組RSPO3（200 ng/mL）、FGF9（200 ng/mL）、WNT3a (50 ng/ml) 、CHIR99021（3 μM）可顯著提高腎小球樣結(jié)構(gòu)的形成效率，且腎小球?yàn)V過功能相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平更接近動(dòng)物體內(nèi)狀態(tài)^[6]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國(guó)家心血管研究中心和美國(guó)哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
RSPO3（Recombinant R-spondin-3，AbMole，M22488）對(duì)干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC、胚胎干細(xì)胞ESC、成體干細(xì)胞）的影響具有階段特異性和譜系選擇性，其作用并非一成不變，而是依賴于分化階段和細(xì)胞微環(huán)境。在體外ESC和iPSC中胚層分化模型中，RSPO3 被鑒定為早期中胚層驅(qū)動(dòng)因子，可以調(diào)控中胚層分化^[7]。在誘導(dǎo)內(nèi)胚層分化的過程中，RSPO3一般與Activin A 、Wnt3a和Wnt通路激動(dòng)劑CHIR99021聯(lián)合使用，其中RSPO3和CHIR99021負(fù)責(zé)激活WNT信號(hào)，Activin A負(fù)責(zé)模擬Nodal信號(hào)^{[8, 9]}。RSPO3 在多種成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，被證實(shí)是維持自我更新能力的關(guān)鍵因子。以腸道干細(xì)胞為例，體外分離的LGR5⁺干細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中易發(fā)生分化，而添加重組 RSPO3 后，細(xì)胞可通過激活 Wnt/β-catenin 通路維持干細(xì)胞標(biāo)志物（如 LGR5、ASCL2）的高表達(dá)，且連續(xù)傳代能力顯著提升。機(jī)制研究表明，RSPO3 通過與 LGR5 結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞膜上 Wnt 受體復(fù)合體的穩(wěn)定性，減少 β-catenin 的降解，從而增強(qiáng)干細(xì)胞的自我更新信號(hào)。此外，RSPO3 （R-spondin-3）可促進(jìn)角膜緣上皮干細(xì)胞（LESC）的增殖和自我更新，其最佳濃度約為150 ng/mL^[10]。RSPO3還可以通過負(fù)調(diào)節(jié)ERK/FGF 信號(hào)通路抑制脂肪來源的干細(xì)胞 （hASC）的成骨分化^[11]。
2. R-spondin 3（RSPO3）在科研中的其它應(yīng)用
RSPO3（Recombinant R-spondin-3，AbMole，M22488）在多種動(dòng)物模型中也有著重要的應(yīng)用，例如RSPO3在C57BL / 6J小鼠模型中可以改善胰島素抵抗，并通過恢復(fù)小鼠器官對(duì)胰島素的敏感性減少脂肪組織增大和防止小鼠體重增加^[12]。在以神經(jīng)元細(xì)胞 （Neuro-2a） 和原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為體外模型的研究中，用 RSPO3 預(yù)處理（50 ng/mL）可改善氧氣和葡萄糖剝奪（OGD/R）誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡和氧化損傷。其分子機(jī)制是RSPO3在神經(jīng)元中激活了Akt、Erk 和 β-Catenin 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中Erk的激活對(duì)上述神經(jīng)元的保護(hù)起到主要作用^[13]。

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參考文獻(xiàn)及鳴謝
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