免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的主要步驟和避免IGG的方法

文章來源公眾號：生物隨筆          作者：陳

一、蛋白與抗體孵育
1、對于一個(gè)六孔板的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度加入約220-250 μL 的IP裂解液，冰上裂解10min。隨后12000 rpm，4℃離心 15 min 后吸取上清蛋白液；
2、取 20-50 μL蛋白液進(jìn)行 BCA 定量。根據(jù)蛋白的濃度吸取一定體積的蛋白液加入適量體積的目標(biāo)一抗（一抗比例根據(jù)說明書，或者蛋白量：抗體=100 ug：1 ul）。BCA 定量剩下的蛋白液作為input樣品置于-20℃保存；
3、同時(shí)平行設(shè)置IgG對照組，加入適量體積的的IgG抗體。將實(shí)驗(yàn)組和IgG組含有抗體的蛋白液放置于4℃搖床孵育過夜；

二、磁珠吸附（第二天）
1、充分重懸管中磁珠；
2、取 40-50 μL  Protein A/G 磁珠轉(zhuǎn)移到 1.5 mL EP 管中；
3、加入約 0.5 ml 洗滌緩沖液，充分重懸磁珠。將 EP 管放入磁力架上，磁性分離。棄上清液。重復(fù)此步驟 2 次。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入適量洗滌緩沖液重懸。
4、向4℃搖床孵育過夜的蛋白-抗體復(fù)合物中，每管加入相當(dāng)于40-50 uL原液的Protein A/G Beads 溶液，輕度渦旋混勻放置于4℃搖床，緩慢結(jié)合 4h;。

若ProteinA/G 與 Beads 結(jié)合導(dǎo)致背景高；使用前使用 1～5% 的 BSA 進(jìn)行預(yù)封閉磁珠、免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和鹽離子濃度

三、蛋白變性洗脫
1、當(dāng)?shù)鞍?抗體復(fù)合物和磁珠孵育結(jié)束后，輕甩離心后置于磁力架進(jìn)行磁性分離，去上清；
2、加入1mL 洗滌緩沖液 清洗beads，共5次；
3、當(dāng)完成最后一次洗滌后，棄去洗滌液加入適當(dāng)體積（約40ul）的 1xloading。 1xloading用IP裂解液稀釋并加入蛋白酶抑制劑。加入loading后，將蛋白樣品通過金屬浴加熱變性即得蛋白樣本，使用磁力架或者離心分離棄去磁珠。后續(xù)通過免疫印跡檢測蛋白的表達(dá)。

#洗滌緩沖液：PBST: 1*PBS +0.5%Tween-20 即50ml PBS + 250μl Tween-20

​四、如何避免IGG
IGG一般有兩條，分別是25和55kDa的輕鏈和重鏈，如果這個(gè)位置恰好在我們的目的條帶附近就會產(chǎn)生干擾。那么如何避免這兩條干擾條帶呢？

如果是外源性蛋白，目標(biāo)蛋白上一般會有標(biāo)簽如Flag這些，那么就可以在免疫沉淀的時(shí)候加入如兔源的Flag抗體，洗脫完WB跑完孵育抗體顯影時(shí)，可以用鼠源的Flag抗體，那么對應(yīng)的二抗就是抗鼠的二抗。此時(shí)抗鼠的二抗一般就不會識別免疫沉淀時(shí)加入的兔源的Flag抗體。因而就不會產(chǎn)生IGG條帶。不過在實(shí)際過程中發(fā)現(xiàn)，即便是這樣也會出現(xiàn)顯影出IGG的輕鏈或者重鏈。也就是這種方法只能規(guī)避掉其中一條鏈，此時(shí)就可以使用特異性識別輕鏈或者重鏈的專用二抗來徹底避免IGG條帶。這種方法適用于實(shí)驗(yàn)室有不同種屬抗體，尤其是標(biāo)簽抗體比較便宜可以實(shí)現(xiàn)。如果僅僅想避免輕重鏈其中一條帶，直接使用特異性識別輕鏈或者重鏈的專用二抗即可。這種方法適用于標(biāo)簽抗體，因?yàn)闃?biāo)簽抗體還是比較便宜的，所以買兩個(gè)不同種屬的標(biāo)簽抗體還是可以接受的。

如果是內(nèi)源性蛋白，要買兩個(gè)不同種屬的抗體可能比較貴。那么要么用特異性識別輕鏈或者重鏈的專用二抗來避免其中的一條帶。要么購買能識別空間構(gòu)象的IP專用二抗。因?yàn)樵贗P免疫沉淀時(shí)加入的抗體，在洗脫后會經(jīng)過煮蛋白的過程，此時(shí)加進(jìn)入的抗體會產(chǎn)生空間構(gòu)象的改變。而后面WB加入的抗體因?yàn)槭钦�常的結(jié)構(gòu)，所以可以利用這點(diǎn)采取識別兩種不同構(gòu)象的二抗。但這種二抗實(shí)際使用效果可能并不是很好，有些反映還是會有IGG條帶。雖然條帶可能會變淡，目的條帶也有可能變淡。