基于光場壓縮的高時空分辨率活體三維成像技術

該研究由Zhaoqiang Wang, Ruixuan Zhao, Daniel A Wagenaar, Diego Espino, Liron Sheintuch, Ohr Benshlomo, Wenjun Kang, Calvin K. Lee, William C. Schmidt, Aryan Pammar, Enbo Zhu, Jing Wang, Gerard C.L. Wong, Rongguang Liang, Peyman Golshani, Tzung K. Hsiai, Liang Gao等合作完成，研究成果于2025年發(fā)表在期刊《nature methods》，文章標題為“Kilohertz volumetric imaging of in vivo dynamics using squeezed light field microscopy”。

重要發(fā)現
01技術原理與光學設計
SLIM的核心思想是通過光學的“壓縮”與“旋轉”編碼，將傳統(tǒng)光場顯微鏡（LFM）所需采集的四維光場信息（二維空間+二維角度）高效地壓縮到二維相機傳感器的一個狹長矩形區(qū)域（ROI）內。其光學系統(tǒng)關鍵包含一個多視角旋轉模塊和一個各向異性中繼系統(tǒng)。多視角旋轉模塊由一系列不同角度的鴿翼棱鏡（Dove Prism）和透鏡陣列（Lenslet Array）組成，每個棱鏡-透鏡對產生一個特定旋轉角度的子孔徑圖像。各向異性中繼系統(tǒng)則使用兩個正交的柱面雙合透鏡，對圖像陣列進行異向縮放，在一個方向上（通常為垂直方向）進行0.2倍的 demagnification（“擠壓”），而在另一方向（水平方向）保持原放大倍率。

這種設計的優(yōu)勢在于充分利用了現代CMOS傳感器的特性。傳感器的幀率僅與需要讀出的像素行數成反比，而與列數無關。通過僅讀取接收光信號的像素行（一個窄條狀ROI），SLIM實現了遠高于全幀模式的讀出速度。例如，使用200x3200像素的ROI，SLIM能以1326 fps（16位）或7476 fps（8位）的速度記錄19個子孔徑圖像，而全幀模式僅能提供83 fps或500 fps。

在計算重建方面，SLIM基于傅里葉切片定理和迭代反卷積算法（Richardson-Lucy）。每個經過擠壓和旋轉的子孔徑圖像，在三維傅里葉頻譜中表現為一個橢圓形的切片。通過融合一系列具有互補旋轉角度的子孔徑圖像，可以填補缺失的高頻信息，合成出接近原始未壓縮光場顯微鏡帶寬的功率譜，從而高保真地重建出三維熒光分布。

02實驗驗證與成像性能
研究團隊搭建了兩套SLIM系統(tǒng)進行驗證：一套采用寬場落射式照明，用于通過顱窗對小鼠進行成像；另一套采用選擇性體積側面照明（如掃描光片或狹縫限制的LED照明），用于斑馬魚幼蟲和解剖的水蛭神經節(jié)等小樣本，以抑制成像體積外的熒光，特別是在散射組織中。

通過對亞衍射尺寸熒光珠的成像，團隊量化了SLIM的成像性能。在3.6倍的放大倍率下，其成像體積可達直徑550微米 x 深度300微米，空間分辨率達到橫向3.6微米，軸向6.0微米。SLIM每秒能夠記錄和重建高達73億個有效體素（7.3 Gigavoxels per second），使其成為文獻中最快的3D熒光顯微鏡之一。

在血流動力學應用中，SLIM以1000 vps的速率對轉基因斑馬魚胚胎（紅細胞表達DsRed）的大腦進行成像。重建結果揭示了紅細胞的三維分布，并允許進行細胞追蹤，從而量化了主動脈和靜脈中脈沖式、空間變化的血流速度，最高可達6 mm/s。其千赫茲成像速度有效消除了運動模糊，實現了穩(wěn)健的細胞追蹤。團隊進一步展示了其對自由擺動（無需鎮(zhèn)靜）斑馬魚尾部的高頻擺動成像，清晰捕捉了紅細胞在血管中的復合運動。

在神經電生理應用中，SLIM的能力得到了極致發(fā)揮。電壓成像因其信號微弱（ΔF/F低）、瞬變極快（毫秒級），對成像系統(tǒng)的時間和靈敏度要求極高。研究團隊對加載了電壓敏感染料（FluoVolt）的藥用水蛭神經節(jié)進行成像，同時使用細胞內微電極進行電生理刺激和記錄作為金標準對照。

SLIM以800 vps的速率采集29個子孔徑圖像，成功重建出的三維圖像序列足以精確采樣神經元動作電位的時序和波形。光學測量結果與電生理記錄在定量細節(jié)上高度一致，包括施加強去極化電流時 spike 幅度的降低。在另一項實驗中，團隊刺激水蛭神經節(jié)誘發(fā)“虛擬游泳”節(jié)律，SLIM清晰地記錄到了不同運動神經元（DI-1, DE-3, VE-4等）中與游泳節(jié)律（1-1.5 Hz）特征一致的節(jié)律性活動，并通過相干性分析量化了各神經元參與節(jié)律生成的幅度和相位，其結果與預測模型高度吻合。

最引人注目的演示是在行為小鼠的海馬體中進行電壓成像。研究通過在CA1區(qū)表達基因編碼電壓指示劑（GEVI）pAce的小鼠顱窗，以800 Hz的體積速率連續(xù)成像三分鐘，同時使用光學旋轉編碼器記錄小鼠在跑步機上的運動。

SLIM提供了跨越大型體積的神經元群體電壓信號的三維映射，允許從不同深度的神經元同時進行光學測量。從提取的膜電位軌跡中，不僅檢測到了強烈的、與運動速度相關的動作電位調制，還觀察到了海馬體中常見的4-10 Hz頻段的細微閾下膜電位振蕩（ likely theta振蕩）。信號保真度通過無活性神經元和背景區(qū)域缺乏此類活動得到進一步證實。大多數神經元的放電頻率與運動速度呈正相關，這與先前發(fā)現一致。

03結合掃描照明提升分辨能力
盡管SLIM等光場技術具有數值重聚焦的能力，但通常缺乏內在的光學切片能力，對高密度標記的物體成像存在挑戰(zhàn)。團隊演示了將SLIM與掃描多平面光片照明相結合的策略。通過掃描光片并使用相機在每次掃描中捕獲多個幀，每個幀對應不同的深度層，顯著抑制了離焦光，提高了重建的軸向分辨率和對比度。

團隊以300 vps的速率對跳動斑馬魚心臟（心肌表達GFP）進行成像。通過以300 Hz掃描雙光片，并與相機以4800 fps（8位速度模式）記錄同步，成功重建了跨越200微米深度范圍的30個平面的心臟結構，心室小梁等微結構清晰可辨。增強的空間分辨率和對比度為心臟腔室?guī)缀涡螤畹臏蚀_分割提供了可能，可用于區(qū)域心肌收縮力分析和血流動力學模擬。

創(chuàng)新與亮點
SLIM技術的核心創(chuàng)新在于它成功突破了高速三維熒光顯微成像中固有的硬件帶寬與有限光子預算之間的瓶頸難題。其技術創(chuàng)新體現在三個方面：

首先，它提出了一種全新的光學壓縮編碼策略。通過鴿翼棱鏡陣列實現多角度旋轉視圖，再結合各向異性的中繼系統(tǒng)進行單向圖像“擠壓”，SLIM巧妙地將傳統(tǒng)上需要大面積傳感器才能記錄的四維光場信息，“壓縮”到一個低格式的狹長傳感器ROI內。這種設計是壓縮傳感思想在光學硬件上的巧妙實現，它基于光場固有的空-角相關性，從壓縮測量中恢復信號，是區(qū)別于現有編碼掩模、隨機擴散片等壓縮光場成像技術的根本性突破。

其次，SLIM實現了前所未有的超高時空分辨率乘積。其數據效率極高，每秒能產生高達73億體素的有效信息量（7.3 Gigavoxels per second），在550x550x300 μm³的視野內，以千赫茲的速率（最高可達1326 vps）進行三維成像，同時保持微米級的分辨率。這將三維成像速度提升了一個數量級，使其能夠捕捉毫秒級的瞬態(tài)生物過程，如神經動作電位和快速血流。

第三，SLIM展現了卓越的系統(tǒng)兼容性和實用性。它無需昂貴且通常性能有所妥協的超高速相機，而是通過優(yōu)化光學設計，將普遍使用的科學級CMOS相機轉化為千赫茲三維成像工具。其壓縮測量大幅降低了數據讀取和存儲的帶寬需求，使得長時間（如數分鐘）連續(xù)記錄大規(guī)模三維數據變得可行，這對于行為動物研究至關重要。同時，SLIM的設計可以改造現有的傅里葉光場顯微鏡，顯著提升其成像速度。

總結與展望
SLIM（壓縮光場顯微鏡）作為一種創(chuàng)新的snapshot三維探測技術，成功解決了對千赫茲速度運行的高速體積顯微鏡的迫切需求。它通過光學編碼和計算重建，巧妙地利用了光場的空-角關聯性和現代CMOS傳感器的特性，實現了在超大視野下的千赫茲三維成像，同時保持了微米級空間分辨率。該技術在活體血流動力學、神經電壓成像和心臟功能研究等多個挑戰(zhàn)性應用中得到了驗證。

展望未來，SLIM技術仍有進一步發(fā)展和優(yōu)化的空間。當前重建算法依賴于樣本的稀疏性先驗，在處理復雜密集信號時性能可能會下降。未來的工作可以集中于開發(fā)更先進的重建算法，特別是嵌入物理模型的深度學習方法，以更好地解決SLIM中因有限空間帶寬和壓縮檢測帶來的病態(tài)逆問題，有望顯著提升其分辨能力和適用場景。此外，與多層掃描光片照明的結合展示了通過權衡成像速度來換取更好光學切片能力的可行性，這種思路可以擴展到其他照明模式。隨著相機技術的不斷進步，SLIM的成像速度有望進一步提升至每秒數萬甚至數十萬體積，為探索生命科學中更快速的動態(tài)過程打開新的大門。總體而言，SLIM為在大型體積內跨層研究不同細胞類型之間的網絡動態(tài)和相互作用提供了一個強大而 accessible 的成像工具，具有巨大的應用前景。

DOI:10.1101/2024.03.23.586416.