抗原和抗體（一抗、二抗）的區(qū)別、種類、特性、制備平臺(tái)及標(biāo)記方法

文章來(lái)源公眾號(hào)：帶你玩轉(zhuǎn)規(guī)律中的邏輯 作者：時(shí)間旅行地圖

一、認(rèn)識(shí)抗體

（一）抗體的里程碑
中國(guó)早在11世紀(jì)的《痘疹定論》這部醫(yī)書(shū)中的“種痘論”里的種痘法已不是原始的，而是相當(dāng)進(jìn)步的一種鼻苗法。一直到18世紀(jì)后的“牛痘”、白喉毒素治療，再到20世紀(jì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體化學(xué)性質(zhì)的研究、結(jié)構(gòu)的解析、模型的構(gòu)建、以及多樣性研究等，無(wú)一不證實(shí)人類對(duì)抗疾病的科學(xué)研究的重大歷史進(jìn)程的研究突破。

（二）抗體的結(jié)構(gòu)
正因?yàn)橛羞@些研究的累積和更新，才讓我們認(rèn)識(shí)到抗體主要是以“Y型”的結(jié)構(gòu)形式存在的（后面會(huì)介紹其它類型的抗體，結(jié)構(gòu)就不單純是Y型）。

根據(jù)抗體的結(jié)構(gòu)解析，將Y型抗體進(jìn)行解構(gòu)分析，得出如下信息。

一個(gè)完整的抗體包含重鏈和輕鏈的部分，其中重鏈用H（Heavy chain）表示，輕鏈用L（Light chain）表示。

對(duì)于鏈上的區(qū)域又分為可變區(qū)（Variable region，V區(qū)）和恒定區(qū)（Constant region，C區(qū)）�？勺儏^(qū)之所以稱之為可變區(qū)是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其氨基端（N-末端）氨基酸序列變化很大；而恒定區(qū)則是因?yàn)槠漪然�端（C-末端）則相對(duì)穩(wěn)定，變化很小。結(jié)合抗原的區(qū)域即發(fā)生在可變區(qū)。

（三）抗體的性質(zhì)
抗體的化學(xué)性質(zhì)是蛋白質(zhì)。在木瓜蛋白酶處理下，F(xiàn)ab區(qū)域從抗體的結(jié)構(gòu)上解離后單獨(dú)形式存在；而在胃蛋白酶處理后，則2個(gè)Fab區(qū)域以二硫鍵的結(jié)合在一起存在，但重鏈的Fc區(qū)域則發(fā)生部分降解；有意思的是在還原劑存在的情況下，重鏈和輕鏈可以單獨(dú)存在，這里主要是因?yàn)檫�原劑和二硫鍵之間產(chǎn)生的反應(yīng)。

（四） 抗體的特性
抗體的產(chǎn)生離不開(kāi)抗原對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的刺激以激活免疫系統(tǒng)應(yīng)答而產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性抗體。這就是抗體的特異性。在展開(kāi)抗體的特異性之前，我們先了解機(jī)體的免疫應(yīng)答。

對(duì)于機(jī)體而言，當(dāng)免疫的第一道和第二道屏障皮膚和粘膜都對(duì)抗原束手無(wú)策了。機(jī)體開(kāi)啟第三道免疫。

首先，病原（抗原）進(jìn)入機(jī)體后先暴露病原體表面的特征性分子，然后被模式識(shí)別受體（PRR）結(jié)合，開(kāi)啟激活免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑。

其次是激活下游的信號(hào)通路，比如NF-κB等，從而導(dǎo)致IL-1、IL-12等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

再者抗原提呈細(xì)胞（APC）吞噬抗原后將其降解為小分子抗原肽，在MHC分子的幫助下，呈遞給T細(xì)胞。

最后，T細(xì)胞響應(yīng)后，分化為不同的細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。而識(shí)別抗原的B細(xì)胞則在Th細(xì)胞的輔助下活化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性抗體，以中和清除抗原、激活補(bǔ)體和效應(yīng)細(xì)胞。同時(shí)B細(xì)胞分化出記憶B細(xì)胞，以“記住”該抗原，待瑕疵同一種抗原刺激機(jī)體后，記憶B細(xì)胞立馬分泌對(duì)應(yīng)的抗體。

回到抗體的特異性上，抗體和抗原可以說(shuō)是鑰匙和鎖的關(guān)系—一把鑰匙開(kāi)一把對(duì)應(yīng)鎖孔的鎖，抗體也是一種抗體對(duì)應(yīng)一種抗原的關(guān)系。

（五）抗體的種類
天然抗體有很多種，其中以IgA、IgD、IgE、IgM、IgG等5種的研究較集中。

IgA：有2種類型，血清型IgA1是單體形式；分泌性IgA2則是二聚體，存在于外分泌液中，初乳中的含量較高（這也是母乳喂養(yǎng)的因素之一）。占血清Ig含量約5-15%。

IgD：?jiǎn)误w，屬于B細(xì)胞表面膜結(jié)合型，是B細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志、抗原受體（BCR）。

IgE：?jiǎn)误w，由呼吸道和胃腸道漿細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體發(fā)生過(guò)敏或寄生蟲(chóng)感染時(shí)水平增高。

IgM：五聚體形式存在，是個(gè)體發(fā)育過(guò)程中最早合成的，也是體液免疫應(yīng)答最先產(chǎn)生的。當(dāng)血清中IgM水平增加，意味著機(jī)體被病原感染了。

IgG：?jiǎn)误w，有4種亞型（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4），其中以IgG1含量最高。

正常機(jī)體血清中的含量占比：IgG > IgA > IgM > IgD > IgE。

半衰期：IgG (20-23 d) > IgA (~ 6 d) > IgM (~ 5 d) > IgD (3 d) = IgE (3 d)。

對(duì)于抗體，人們也可以根據(jù)具體的應(yīng)用場(chǎng)景做抗體的改造。回顧下抗體的結(jié)構(gòu)（上述第三張圖），抗原結(jié)合區(qū)域CDRs是關(guān)鍵。因此，可以對(duì)抗體進(jìn)行改造，如只針對(duì)腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞內(nèi)外無(wú)影響的雙特異性抗體，又如靶向某種疾病時(shí)在抗體Fc區(qū)域結(jié)合藥物進(jìn)行治療的抗體偶聯(lián)藥物，再如為了提高免疫組化的組織滲透而降低背景信號(hào)的片段抗體等等。

而這些人為設(shè)計(jì)的抗體，都需要考慮到與抗體的親和力、副作用等。除此之外還要考慮到具體的應(yīng)用場(chǎng)景：是要設(shè)計(jì)為ATP抗體、pH依賴性抗體、表位抗體，還是要偶聯(lián)抗體、阻斷非特異性結(jié)合的片段抗體等等。

二、抗體的制備

（一）抗原
人類終生接觸的抗原能達(dá)到上億種，但不是所有的抗原都會(huì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，因?yàn)檫�有皮膚和粘膜的兩大防線。但，引發(fā)機(jī)體免疫的抗原也是不少，大體分為8大類。

（二）抗體的多樣性

正因?yàn)榭乖�的多樣性，所以要求機(jī)體產(chǎn)生的抗體也要多樣性，畢竟一種抗體不能解決所有問(wèn)題。那機(jī)體該如何解決抗體的多樣性呢？

首先，要先了解人類免疫球蛋白基因庫(kù)是包含數(shù)百個(gè)基因片段的：

重鏈（Heavy Chain）：VH（45-100個(gè)）、DH（23-30個(gè)）、JH（6-9個(gè)）；

輕鏈（Light Chain）：κ鏈：Vκ（30-40個(gè)）+ Jκ（5個(gè)）、λ鏈：Vλ（30個(gè)）+ Jλ（4個(gè)）；

根據(jù)排列組合，重鏈組合是100 × 30 × 9 ≈ 1.8 × 104（個(gè)），輕鏈組合是(Vκ×Jκ) + (Vλ×Jλ) ≈ (40×5) + (30×4) = 320（個(gè)）。

那么，重鏈和輕鏈的所有組合為：1.8×104×320 = 5.76×106（種）。即有百萬(wàn)種抗體。如果再考慮VDJ區(qū)域連接過(guò)程引入的隨機(jī)性、體細(xì)胞堿基突變、抗原表位空間構(gòu)象變化等，抗體是有上億種的。

（三）抗體制備平臺(tái)
既然了解到抗原的種類和抗體產(chǎn)生的多樣性，那該如何制備抗體呢？不可能為了研究某一抗原就讓人感染后讓人產(chǎn)生抗體吧！畢竟，違背倫理。該如何解決抗體制備的問(wèn)題呢？

這里，不得不提及抗體制備的3大平臺(tái)：通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體的制備。

每種技術(shù)平臺(tái)針對(duì)性不同，可根據(jù)具體的應(yīng)用和要求選擇適合自己開(kāi)發(fā)抗體的方式。

（四）獲取抗原
我們都知道天然抗原是最佳選擇用于免疫動(dòng)物的—因其天然構(gòu)象和修飾是人為改造所不能及的。然而，要想獲取天然抗原就需要該種抗原穩(wěn)定性好—不能因?yàn)槿藶榧兓�過(guò)程而改變構(gòu)象或修飾，頁(yè)需要該種抗原的量滿足實(shí)驗(yàn)用量—過(guò)少的抗原無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)重復(fù)、接種劑量等達(dá)不到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

因此，退而求其次，選擇合適的抗原是關(guān)鍵。一般實(shí)驗(yàn)時(shí)的抗原歸為兩大類：小分子類和蛋白類。

小分子類：如多肽、多糖等，可通過(guò)人工合成或提取的方式獲得。但是因該類抗原分子量小，單獨(dú)存在時(shí)難以激活免疫系統(tǒng)，必須在具備抗原決定簇的載體蛋白作用下，才能激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答和抗體。

這類分子與載體蛋白需要通過(guò)偶聯(lián)的方式存在，才能更好的進(jìn)入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。與載體蛋白的偶聯(lián)方式主要有3種，分別如下。
（1）巰基–SH介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián)：cKLH載體蛋白與sulfo-SMCC的偶聯(lián)；
（2）EDC或EDC/NHS介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián)（氨基-羧基）；
（3）GA( Glutaraldehyde,戊二醛)介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián)；

其中，以sulfo-SMCC的偶聯(lián)方式為主。而偶聯(lián)的本質(zhì)是小分子的-NH2（氨基）等基團(tuán)與載體蛋白在偶聯(lián)劑的作用下，發(fā)生有機(jī)化學(xué)的親核取代或加成反應(yīng)。（關(guān)于偶聯(lián)，在后續(xù)的二抗部分也會(huì)講到）。

重組蛋白類：該類抗原需要通過(guò)基因工程的方式，分析與設(shè)計(jì)抗原的表位序列信息，通過(guò)體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出蛋白后，作為抗原注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫。

常見(jiàn)的體外表達(dá)系統(tǒng)如下所示。

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)也越發(fā)盛行，感興趣的可以搜索有關(guān)文獻(xiàn)閱讀，本文不再敘述。

（五）佐劑與免疫動(dòng)物
有了抗原，是不是就能夠直接進(jìn)行免疫動(dòng)物了？答案是否定的。因?yàn)椋�這里還需要介紹下免疫動(dòng)物時(shí)需要的佐劑。

為什么要使用佐劑呢？在此之前，我們先以弗氏佐劑的制備作為引子。

福氏不完全佐劑（FIA）的制備：先稱取羊毛脂 2g，放入無(wú)菌乳缽內(nèi)，再用吸管吸取液體石蠟 4mL，加入放有羊毛脂的乳缽中，沿一個(gè)方向邊滴加邊研磨混勻。

福氏完全佐劑（FCA）的制備：在上述的福氏不完全佐劑中再逐滴加入卡介苗 1mL，沿一個(gè)方向邊滴邊研磨，使菌體完全分散乳化。

這里值得說(shuō)下卡介苗，其實(shí)就是減毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液制成的活菌苗。減毒活菌是能極大的引起機(jī)體免疫的。由此，可以看出，佐劑其實(shí)是增強(qiáng)免疫應(yīng)答的�？墒�，在注射抗原的時(shí)候抗原也能因其免疫��！因?yàn)閱渭冏⑸淇乖�往往難以誘導(dǎo)高水平抗體產(chǎn)生。所以，為了提高抗體效價(jià)，就需要通過(guò)增強(qiáng)B細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生高濃度的特異性抗體；為了縮短免疫周期，減少免疫次數(shù)；為了刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的記憶B細(xì)胞，從而使抗體在體內(nèi)維持更長(zhǎng)的時(shí)間；佐劑是必不可少的。

可以理解為佐劑是為了提高免疫原性的�。ㄒ�?yàn)槊庖咴�性越高，產(chǎn)生的抗體越好）。

對(duì)于免疫的動(dòng)物。我們分2部分講解：免疫動(dòng)物的選擇、和如何免疫動(dòng)物。

首先，免疫動(dòng)物的選擇，一般選擇鼠、或者兔子。而單克隆抗體則以小鼠品系BALB/c使用的最多。原因在于該品系小鼠是近交系，至少經(jīng)過(guò)20代的同窩交配培育而成。同品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先；基因純合，同基因型，表型均一，遺傳穩(wěn)定，背景資料完整。多克隆抗體一般選擇免疫兔子。兔通常用為腫瘤發(fā)生以及損傷和傷口愈合以及其他應(yīng)用的有用研究模型，因其免疫范圍更廣，可以產(chǎn)生的抗體種類和數(shù)量則更多，選擇性更多。

其次，免疫動(dòng)物需要關(guān)注劑量、免疫部位和免疫周期。對(duì)于免疫劑量，首次免疫小鼠的劑量為每次50～400μg，大鼠為每次 100μg～1mg，兔為每次200μg～1mg。加強(qiáng)免疫劑量為首次劑量的 1/5～2/5。對(duì)于免疫部位，抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及實(shí)驗(yàn)要求，選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、腹腔、靜脈或淋巴結(jié)等不同途徑進(jìn)行免疫。一般多采用動(dòng)物的背部、足掌、淋巴結(jié)周圍、耳后等處皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射。對(duì)于免疫周期，一般第一次和第二次間隔10～20d，3次及以后間隔7～10d，加佐劑者應(yīng)為2周左右。免疫的總次數(shù)一般為 5～8 次。

如果要制備高度特異性的抗血清，可選擇用低劑量抗原短程免疫的方法；但如果想獲得高效價(jià)的抗血清，則需要用大劑量抗原長(zhǎng)程免疫方法。

（六）血清效價(jià)評(píng)估
在接入抗體發(fā)現(xiàn)3大平臺(tái)之前，還需要對(duì)免疫的動(dòng)物血清中產(chǎn)生的抗體效價(jià)進(jìn)行評(píng)估，這是評(píng)判免疫動(dòng)物效果的方式之一。常用的方法為間接ELISA。

采用間接ELISA進(jìn)行效價(jià)評(píng)估時(shí)，動(dòng)物的采血部位有小鼠等小型動(dòng)物采用尾尖采血，單次取0.1mL血液；或眶后靜脈叢采血（0.2-0.3mL）及下頜靜脈采血。其它的如摘眼球取血或心臟取血等。

采集的血液可選擇靜置或離心的方式分離出血清。進(jìn)行ELISA時(shí)選擇PBS或者生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。以樣本檢出值/陰性對(duì)照值>2.1視為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，而此時(shí)稀釋的血清倍數(shù)則為，比如稀釋了320,000倍，其效價(jià)為1:320000。

至于抗原包被酶標(biāo)板，可參考如下方法。

步驟一、 包被
物理吸附：利用酶標(biāo)板材料聚苯乙烯與蛋白（pH9.6緩沖液）的疏水作用和靜電吸附。
對(duì)象：抗體、重組抗原、病毒蛋白
化學(xué)偶聯(lián)：利用化學(xué)交聯(lián)劑EDC/NHS將蛋白的-NH2或-COOH與酶標(biāo)板表面活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
對(duì)象：小分子抗原（如短肽、激素）
蛋白濃度要求：1-10 μg/mL（濃度高造成多層吸附，濃度低信號(hào)弱）。
包被條件：50-100 μL/孔，4℃過(guò)夜

步驟二、封閉（BSA、脫脂奶粉、絡(luò)蛋白，以防止非特異性結(jié)合）
1-5% BSA或5%脫脂奶粉（PBS配制）
100-200 μL/孔，37℃ 1-2 h，或4℃過(guò)夜。

步驟三、清洗，洗液：1×PBS（含1% Tween-20），清洗2-3次。

緊跟著就到了接3大抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。

至于接的不同抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的時(shí)間，一般雜交瘤平臺(tái)選擇末次免疫第3天，單B細(xì)胞平臺(tái)免疫后7-14天（外周血記憶B細(xì)胞高峰期），噬菌體平臺(tái)則在免疫后28-42天（加強(qiáng)免疫后14天建庫(kù)）。

（七）二抗
繼特異性的一抗后，二抗閃亮登場(chǎng)。從上述ELISA列表中，可以看出，不是所有的ELISA實(shí)驗(yàn)都需要二抗的，比如直接法，但這種直接標(biāo)記一抗的情況往往會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。為了解決這類問(wèn)題，二抗誕生了—放大一抗的信號(hào)，讓檢測(cè)不再困難。

本文上面的第二張圖表明抗體是可以根據(jù)實(shí)際目的進(jìn)行人為改造的。那么對(duì)應(yīng)的二抗也是有類似的原則。

那二抗既然是放大一抗的信號(hào)的，是否需要有什么標(biāo)記來(lái)標(biāo)記二抗，這樣能夠很好的檢測(cè)抗體信號(hào)？這里需要提及一個(gè)問(wèn)題，就是什么實(shí)驗(yàn)需要基于顏色（可見(jiàn)光或熒光）做標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。具體需要的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景有WB、IHC、IF、FACS、ELISA等。

有哪些標(biāo)記二抗的方法呢？主流的分為3種，分別是酶標(biāo)法、生物素法、熒光法。這3種方法都離不開(kāi)化學(xué)偶聯(lián)劑。

首先，先說(shuō)下酶標(biāo)法。酶標(biāo)法常用的酶以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP或AP）為主。

HRP常用底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB），其與TMB反應(yīng)后變?yōu)樗{(lán)色，加入硫酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色；與DAB反應(yīng)后產(chǎn)生棕色沉淀。通過(guò)顏色變化可肉眼或光學(xué)顯微鏡下直接觀察。

AP常用底物為對(duì)-硝基苯磷酸酯（p-NPP）、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）/硝基藍(lán)四唑（NBT）等，其與BCIP/NBT反應(yīng)顯藍(lán)紫色。也可通過(guò)顏色變化肉眼或光學(xué)顯微鏡下直接觀察。

上述二者與二抗的偶聯(lián)，也是離不開(kāi)偶聯(lián)劑在中間行使功能的。當(dāng)然也可以通過(guò)其它方法，比如通過(guò)基因工程融合的方法將ALP與抗體的Fc區(qū)域融合表達(dá)出天然ALP抗體。

在選擇什么酶做標(biāo)記方面：
HRP：靈敏度較高，價(jià)格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，但容易受到疊氮化鈉、氰化物等抑制劑的影響。
AP：靈敏度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值較低，但價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率較HRP低，且對(duì)溫度和pH值較為敏感。
生物素法，則是有賴于生物素分子自身的化學(xué)性質(zhì)決定的，如其含有的-NH2（氨基）、-SH（巰基）、CHO（醛基）等與偶聯(lián)劑反應(yīng)。

而親和素和生物素之間有很強(qiáng)的作用，且一個(gè)親和素可以結(jié)合4個(gè)生物素，可以將信號(hào)放大4倍。（這里不得不提一下Element Biosciences的親和子測(cè)序，其親和子也是通過(guò)親和素實(shí)現(xiàn)的）小Tips：能否用于空間組學(xué)？

至于熒光法，可以直接通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)的方式結(jié)合熒光基團(tuán)，也可以通過(guò)NHS酯反應(yīng)或馬來(lái)先酰亞胺反應(yīng)生成。

總結(jié)下有關(guān)抗體標(biāo)記的信息。

應(yīng)用到其它實(shí)驗(yàn)方面：
免疫沉淀/免疫共沉淀：生物素化抗體+鏈霉親和素包被的磁珠/瓊脂糖珠。
親和純化：生物素化抗體固定在鏈霉親和素包被的層析柱上，用于純化特定抗原。