利用NIR-II 成像進(jìn)行精確接種增強(qiáng) mRNA 疫苗的功效

本文要點(diǎn)：本文將陽(yáng)離子熒光兩親性分子（IR780-C16）整合到傳統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）中，制備了近紅外二區(qū)（NIR-II）脂質(zhì)納米顆粒（NIR-II-LNPs），用于mRNA遞送，實(shí)現(xiàn)了mRNA疫苗的縱向、定量和非侵入性追蹤。通過(guò)NIR-II熒光成像，監(jiān)測(cè)了小鼠和兔子在不同疫苗接種方案下mRNA疫苗的體內(nèi)行為。結(jié)果表明，在小鼠大腿肌內(nèi)注射25 µL（深度4 mm）或兔子肌內(nèi)注射500 µL（深度7 mm）后，疫苗迅速且大量富集于腹股溝淋巴結(jié)。流式細(xì)胞術(shù)和組織免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證，優(yōu)化的疫苗接種參數(shù)可有效激活抗腫瘤免疫，并在B16-OVA和HPV相關(guān)小鼠腫瘤模型中顯著增強(qiáng)治療效果。NIR-II-LNPs提供了一種獨(dú)特的非侵入性監(jiān)測(cè)疫苗效果的方法，鞏固了其在臨床前和臨床mRNA治療中的作用。

 

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本文通過(guò)將IR780-C16整合到脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）中，開(kāi)發(fā)了新型近紅外二區(qū)熒光LNPs（NIR-II-LNPs），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疫苗分布并驗(yàn)證疫苗接種方案與免疫應(yīng)答的關(guān)聯(lián)性（方案1）。在小鼠和兔子模型中采用不同注射深度和體積接種后，NIR-II-LNPs實(shí)現(xiàn)了對(duì)mRNA疫苗遷移和攝取的非侵入性、動(dòng)態(tài)定量追蹤。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用最佳深度進(jìn)行肌內(nèi)注射時(shí)，mRNA疫苗能快速遷移至腹股溝淋巴結(jié)（iLNs），而不當(dāng)?shù)淖⑸浞桨竸t會(huì)導(dǎo)致信號(hào)長(zhǎng)期滯留于注射部位。進(jìn)一步構(gòu)建了mRNA癌癥疫苗（NIR-II-LNPs@mRNAOVA、NIR-II-LNPs@mRNAE7），在B16-OVA和HPV相關(guān)荷瘤小鼠模型中分析其動(dòng)態(tài)分布對(duì)免疫應(yīng)答及抗腫瘤效果的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用優(yōu)化接種參數(shù)的NIR-II-LNPs@mRNA疫苗能顯著促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞（DCs）成熟、提升抗原特異性T淋巴細(xì)胞水平，并顯著增強(qiáng)抗腫瘤效果。該研究充分展現(xiàn)了NIR-II-LNPs作為新一代載體在優(yōu)化mRNA疫苗接種方案和提升疫苗效能方面的卓越潛力。

圖1. NIR II LNPs示意圖和表征

 

IR780-C16用于標(biāo)記傳統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），形成的近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光探針具有毫米級(jí)組織穿透深度和優(yōu)異信噪比。LNPs由ALC-0315（50%）、DSPC（10%）、ALC-0159（1.5%）和膽固醇（38.5%）按特定摩爾比組成（圖1A-C），而NIR-II-LNPs在此基礎(chǔ)上整合了0.5%質(zhì)量比的IR780-C16（圖1A,B），其封裝效率超過(guò)96%。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）顯示LNPs和NIR-II-LNPs的流體力學(xué)直徑分別為78.4±1.7 nm和75.0±1.6 nm（圖1D,G），冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）證實(shí)二者均呈均勻球形（圖1E,H）。Zeta電位分析表明IR780-C16的引入未影響納米顆粒組裝（圖1I），且在PBS中一周內(nèi)粒徑保持穩(wěn)定（圖1J）。紫外-可見(jiàn)光譜顯示NIR-II-LNPs在790 nm處有特征吸收峰（圖1C,F,K），并在NIR-II光譜區(qū)（>1000 nm）呈現(xiàn)顯著熒光增強(qiáng)（圖1L），其量子產(chǎn)率較游離IR780-C16提升11.3倍（圖1M），這歸因于納米載體抑制了分子間π-π堆積和內(nèi)部旋轉(zhuǎn)，減少了聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)。在808 nm激光持續(xù)照射下，NIR-II-LNPs在1400 nm亞NIR-II窗口仍保持穩(wěn)定熒光強(qiáng)度（圖1N,O）。組織模擬實(shí)驗(yàn)顯示，相較于NIR-I窗口（850-900 nm）的局限穿透（<3 mm）和嚴(yán)重散射，NIR-II成像（>1100 nm）在7 mm深度仍能清晰分辨毛細(xì)血管邊緣（圖1P），且半峰寬（FWHM）更窄（圖1Q），充分證明NIR-II-LNPs適用于深層組織成像。

圖2. 不同注射方案的NIR-II成像研究

 

肌內(nèi)注射作為一種廣泛采用的疫苗接種方式，其注射深度對(duì)免疫應(yīng)答的激活具有決定性作用。本文采用NIR-II-LNPs作為遞送載體，實(shí)現(xiàn)了mRNA疫苗在體內(nèi)遷移和生物分布的可視化追蹤。通過(guò)在C57BL/6小鼠右大腿分別以2 mm（I組）、4 mm（II組）、6 mm（III組）深度注射25 μL NIR-II-LNPs@mRNA（圖2A），動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯示：I組疫苗在注射4小時(shí)后腹股溝淋巴結(jié)（iLNs）信號(hào)達(dá)到峰值，而II組和III組在24小時(shí)內(nèi)持續(xù)富集，其中II組熒光強(qiáng)度顯著優(yōu)于其他組（圖2B,C）。24小時(shí)后組織分布分析證實(shí)，II組iLNs中疫苗蓄積量分別是I組和III組的4.4倍和2.0倍（圖2D-F）。進(jìn)一步探究注射體積影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在最佳深度下，50 μL注射量能最有效促進(jìn)疫苗向iLNs轉(zhuǎn)運(yùn)，而100 μL組則導(dǎo)致更多疫苗在肝臟蓄積。實(shí)時(shí)熒光成像清晰捕捉到疫苗在最佳接種條件下經(jīng)淋巴管向iLNs和腋窩淋巴結(jié)（aLNs）遷移的動(dòng)態(tài)過(guò)程（圖2G）。該研究首次通過(guò)NIR-II成像技術(shù)建立了疫苗接種參數(shù)與免疫效能的定量關(guān)系，為優(yōu)化mRNA疫苗遞送方案提供了可視化依據(jù)。

圖3. 兔子NIR-II成像研究

 

為排除可能阻礙臨床轉(zhuǎn)化的物種特異性差異，研究人員在雌兔模型中評(píng)估了NIR-II-LNPs@mRNA的生物分布特性。實(shí)驗(yàn)采用三種不同注射深度（圖3A,B）肌注500 µL疫苗，結(jié)果顯示：7 mm注射組在給藥4小時(shí)內(nèi)即可在腹股溝淋巴結(jié)（iLNs）快速蓄積，而4 mm和10 mm組iLNs區(qū)域幾乎檢測(cè)不到信號(hào)（圖3C-E）。這一結(jié)果明確證實(shí)，疫苗的有效遞送依賴于最佳深度的精準(zhǔn)注射，從而驗(yàn)證了前述結(jié)論的準(zhǔn)確性和普適性。通過(guò)NIR-II體視顯微技術(shù)進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)（圖3F,G），疫苗熒光信號(hào)主要富集于iLNs邊緣的被膜下竇（SCS）區(qū)域（圖3H），表明抗原通過(guò)輸入淋巴管運(yùn)輸后被沿SCS分布的抗原呈遞細(xì)胞（APCs）捕獲。該研究實(shí)現(xiàn)了疫苗在淋巴結(jié)遷移滯留過(guò)程的實(shí)時(shí)示蹤，為優(yōu)化疫苗劑量和注射方案提供了強(qiáng)有力的研究工具。

 

圖4. 荷瘤小鼠疫苗接種的治療實(shí)驗(yàn)

 

淋巴結(jié)是抗原呈遞細(xì)胞（APCs）與初始T細(xì)胞相互作用、引發(fā)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵場(chǎng)所。理想的疫苗接種方案應(yīng)能促進(jìn)APCs成熟、增強(qiáng)APCs-T細(xì)胞互作并激發(fā)強(qiáng)效免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)低抗原用量下的長(zhǎng)效免疫（圖4A）。研究者在B16-OVA荷瘤小鼠模型中評(píng)估了不同接種方案對(duì)腫瘤引流淋巴結(jié)（dLNs）中APCs及外周血T細(xì)胞的影響（圖4B）。將5 μg編碼OVA（257-264）-熒光素酶的mRNA（mRNAOVA-Luc）封裝于NIR-II-LNPs（終體積25 μL），分別以2 mm、4 mm、6 mm深度肌注小鼠右腿后，4 mm深度組dLNs顯示出最強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)（圖4C），證實(shí)該深度能顯著提升mRNA體內(nèi)翻譯效率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4 mm-50 μL組（V組）DCs表面H-2Kb/SIINFEKL復(fù)合物陽(yáng)性率（29.9%）較對(duì)照組（4.96%）提升6倍（圖4D,E），免疫熒光分析同樣顯示該組DCs活化標(biāo)志物CD80/CD86表達(dá)最顯著（圖4G）。二次免疫7天后，4 mm-50 μL組外周血腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞比例達(dá)20.5%（對(duì)照組5.44%），同時(shí)OVA特異性IgG抗體滴度顯著升高（圖4H,I）。這些數(shù)據(jù)表明，優(yōu)化后的接種參數(shù)（4 mm深度+50 μL體積）能協(xié)同增強(qiáng)mRNA疫苗的抗原呈遞、T細(xì)胞激活及體液免疫應(yīng)答，且未引起明顯體重變化。

圖5. NIR-II-LNPs@mRNAE7癌癥疫苗治療研究

 

本文在TC-1皮下腫瘤模型中評(píng)估了NIR-II-LNPs@mRNAE7疫苗的抗腫瘤效果。該疫苗靶向E7癌蛋白，能有效對(duì)抗以HPV16型為主的高危HPV毒株——宮頸癌的主要致病因子。實(shí)驗(yàn)方案如圖5A,B所示：第0天接種TC-1細(xì)胞，第10天進(jìn)行初免，第17天加強(qiáng)免疫。通過(guò)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)（圖5C,D），采用優(yōu)化接種參數(shù)（4 mm-50 µL）的疫苗組展現(xiàn)出持續(xù)抑瘤效果，腫瘤生長(zhǎng)抑制率（TGI）高達(dá)70.9%（圖5E-G），并顯著延長(zhǎng)了小鼠中位生存期（圖5H）。機(jī)制研究表明，疫苗組引流淋巴結(jié)中CD80+CD86+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（50.3% vs 11.0%），尤其是4 mm-50 µL組DCs活化水平最為突出（圖5I,J）。腫瘤組織免疫熒光分析顯示，疫苗組腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+和CD4+ T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并伴隨穿孔素（PFN）和顆粒酶B（GzmB）等殺傷分子的大量分泌（圖5K）。血液生化及主要器官H&E染色證實(shí)疫苗未引起明顯毒性反應(yīng)，表明該mRNA疫苗在實(shí)現(xiàn)卓越抗腫瘤效果的同時(shí)具有良好的安全性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，疫苗的精準(zhǔn)遞送對(duì)激發(fā)最佳T細(xì)胞免疫至關(guān)重要。

 

綜上所述，本文成功開(kāi)發(fā)了新型近紅外二區(qū)（NIR-II）發(fā)光脂質(zhì)納米粒（NIR-II-LNPs），實(shí)現(xiàn)了mRNA的高效遞送與疫苗運(yùn)輸過(guò)程的非侵入式成像。NIR-II示蹤數(shù)據(jù)直接證明：疫苗注射深度和體積顯著影響其體內(nèi)分布，并最終調(diào)控疫苗特異性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)納米疫苗精準(zhǔn)注射至最佳組織深度時(shí)，能更有效地通過(guò)淋巴管遷移至腹股溝淋巴結(jié)（iLNs）。得益于在淋巴結(jié)的高效蓄積及優(yōu)化接種參數(shù)下樹(shù)突細(xì)胞（DCs）的強(qiáng)力激活，兩種腫瘤疫苗（NIR-II-LNPs@mRNAOVA和NIR-II-LNPs@mRNAE7）在B16-OVA和HPV相關(guān)小鼠腫瘤模型中均展現(xiàn)出卓越的抗腫瘤效果。相較于傳統(tǒng)需處死動(dòng)物的離體研究，本研究首創(chuàng)了非侵入、縱向、實(shí)時(shí)的體內(nèi)mRNA疫苗示蹤策略，為探索不同接種條件下的疫苗效力提供了關(guān)鍵依據(jù)。該平臺(tái)技術(shù)有望拓展至其他疫苗的體內(nèi)研究，加速免疫效果驗(yàn)證并指導(dǎo)更有效疫苗的設(shè)計(jì)。

 

參考文獻(xiàn)

Mengfei Li, Xue Zheng, Xinyang Yu, Shaolong Qi, Shoujun Zhu,* Guocan Yu, and Songling Zhang., Potentiating the Efficacy of mRNA Vaccines through NIR-II Imaging-Guided Precise Vaccination., Adv. Sci. 2025, e13014

 

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