REPS2通過自噬介導(dǎo)的β-catenin蛋白的降解抑制腫瘤細(xì)胞的干性

文獻(xiàn)信息
暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究所廣東省高校功能蛋白研究重點(diǎn)實驗室和教育部腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室等單位的研究成果“REPS2 attenuates cancer stemness through inhibiting Wnt signaling by autophagy mediated degradation of β-catenin（REPS2通過自噬介導(dǎo)的β-catenin蛋白的降解來抑制Wnt信號通路從而抑制腫瘤細(xì)胞的干性）在雜志《Oncogene》（IF：7.3）上發(fā)表。平生公司的活體CT（Super nova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

該研究的通訊作者陳良教授，第一作者為劉鷺老師。

文獻(xiàn)背景
調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞干性的腫瘤抑癌基因（TSG）仍有待確定。作者利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的全基因組規(guī)模的關(guān)于肺癌干性基因的篩選，并確定REPS2是一種有效的TSG，對肺癌細(xì)胞的干性進(jìn)行負(fù)調(diào)控。其抑癌作用在體外和體內(nèi)都得到了證實。從機(jī)制上講，P62同時與β-catenin和REPS2相互作用，導(dǎo)致自噬溶酶體介導(dǎo)的β-catenin的降解從而抑制Wnt信號傳導(dǎo)。β-catenin的抑制劑與驅(qū)動突變抑制劑協(xié)同誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡，可用于提高腫瘤免疫治療的療效。

實驗方法
動物實驗
對于異種移植瘤模型，在6-8周齡的雌性裸鼠皮下植入2×10⁶個A549細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有通過CRISPR篩選敲除的前10個候選基因。將小鼠隨機(jī)分為幾組，每組三只。4周后，處死小鼠并解剖腫瘤負(fù)荷。對于LLC異種移植瘤模型，在6-8周齡的雌性WT小鼠上皮下接種2×10⁶ LLC（Vehicle或OE REPS2）。將小鼠隨機(jī)分組，每組4只。腫瘤體積達(dá)到100mm³時進(jìn)行測量。2周后，處死小鼠并解剖腫瘤負(fù)荷。

將過表達(dá)REPS2（KC+R）或Vehicle的逆轉(zhuǎn)錄病毒通過鼻孔吸入6-8周齡的TetO-KrasG12D/CC10rtTA（指定為KC）雙轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的肺部。將小鼠隨機(jī)分組，每組4只。所有小鼠均喂食含有Dox的食物3個月。計算機(jī)斷層掃描（Super nova CT，平生醫(yī)療科技有限公司）用于量化腫瘤負(fù)荷。

將含有Cre和Cas9的慢病毒注入6-8周齡的LSLKRASG12D雌性小鼠的肺部。感染后6個月，通過CT監(jiān)測REPS2基因敲除小鼠（K-sgREPS2小鼠）和TdTomato基因敲除鼠（K-sgTD小鼠作為對照）的腫瘤負(fù)荷。對于K-sgREPS2小鼠治療，將小鼠隨機(jī)分為幾組，每組4只。用ICG001（腹膜內(nèi)注射，25mg/kg/天）、曲美替尼（強(qiáng)飼，1mg/kg/天）和PD-1抗體（腹膜內(nèi)注入，5mg/kg/天）治療小鼠2周。通過計算機(jī)斷層掃描監(jiān)測腫瘤負(fù)荷。

實驗結(jié)果
REPS2在體內(nèi)肺癌小鼠模型中是一種有效的腫瘤抑制因子
將REPS2過表達(dá)LLC細(xì)胞的同種異體移植腫瘤（LLC-REPS2oe）的生長速度明顯慢于對照細(xì)胞（圖4A）。此外，作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過表達(dá)顯著抑制了CD44的表達(dá)（圖S4A）。小鼠原位肺癌模型更好地再現(xiàn)了患者腫瘤發(fā)展的臨床過程。前期，作者報道了一種肺癌小鼠模型TetO-KrasG12D；CC10rtTA（指定為KC小鼠），在四環(huán)素飲食誘導(dǎo)（Dox）3個月之后，由KrasG12D驅(qū)動發(fā)展為肺癌。然后，作者通過鼻內(nèi)滴注（指定為KC+R）用含有Teton-REPS2的慢病毒感染這些小鼠。WB分析證實了Dox誘導(dǎo)3個月后KC+R小鼠肺組織中REPS2的表達(dá)（圖S4B）。作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過度表達(dá)顯著抑制了肺癌的形成（圖4B–F）。蘇木精和伊紅（H&E）染色檢查顯示，REPS2的過度表達(dá)顯著抑制了KC+R小鼠肺癌的形成（圖4B）。此外，作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過表達(dá)顯著抑制了對CD44的表達(dá)（圖S4C）。相反，按照先前報道的通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Lsl-KrasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠的肺癌小鼠模型中敲除腫瘤抑制基因的程序，作者將靶向Td-tomato（作為陰性對照，K-sgTD）或REPS2（K-sgREPS2）的慢病毒鼻內(nèi)遞送到Lsl-KrasG12D小鼠中。與對照組相比，經(jīng)鼻吸入慢病毒6個月后，作者檢測到REPS2敲除小鼠的腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤直徑和III期腫瘤數(shù)量顯著增加（圖4G-K）。此外，作者通過免疫組織化學(xué)檢測到REPS2敲除的腫瘤中CD44的表達(dá)顯著升高（圖S4D，E）。

圖4 REPS2在體內(nèi)肺癌小鼠模型中是一種有效的腫瘤抑制因子。A. REPS2過表達(dá)對LLC異種移植物腫瘤的影響。腫瘤體積和腫瘤重量統(tǒng)計如下。B.REPS2過表達(dá)對轉(zhuǎn)基因小鼠原位肺腫瘤形成的影響。相應(yīng)的HE分析圖像如下所示。C-F.腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤大小和腫瘤III期數(shù)量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。G.敲除REPS2對Lsl-KrasG12D小鼠腫瘤形成的影響。相應(yīng)的HE分析圖像如下所示。H-K腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤大小和腫瘤III期數(shù)量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

聯(lián)合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增強(qiáng)REPS2缺陷/Kras突變型肺癌免疫治療

作者生成了一批攜帶K-sgREPS2肺癌的小鼠，并用ICG001、曲美替尼和PD-1抗體治療這些小鼠2周。作者發(fā)現(xiàn)，與ICG001和曲美替尼的組合相比，ICG001、曲美替尼和PD-1抗體治療顯著抑制了腫瘤生長（圖7E、F）。此外，F(xiàn)ACS分析顯示，聯(lián)合治療顯著增加了腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)（圖7G，H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，ICG001、曲美替尼和PD-1抗體的組合有效地抑制了KrasG12D/REPS2-/-肺癌。

圖7 聯(lián)合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增強(qiáng)REPS2缺陷/Kras突變肺癌免疫治療。E .ICG001、曲美替尼和PD-1抗體聯(lián)合治療可有效縮小K-sgREPS2小鼠的肺腫瘤。相關(guān)HE分析如下所示。F.用（E）的聯(lián)合療法治療的小鼠腫瘤負(fù)荷的定量。

文獻(xiàn)結(jié)論

免疫療法改變了當(dāng)前臨床腫瘤學(xué)實踐的范式。不幸的是，大多數(shù)患者未能從免疫療法中受益。典型免疫療法的組合，如PD-1抑制劑和CTLA4抑制劑之間、PD-1和LAG3之間以及PD-1和TIGIT之間，正在臨床試驗中積極測試。免疫療法也與化療和靶向治療相結(jié)合。然而，在上述所有組合中，耐藥性仍然是一個棘手的問題。作者目前的工作為一個研究不足的領(lǐng)域提供了新的思路：通過識別強(qiáng)效TSG的功能喪失并闡明隨之而來的異常信號，研究人員可以識別由這種異常信號產(chǎn)生的藥物靶點(diǎn)。因此，考慮到這些藥物與免疫療法的潛在聯(lián)合，可能會導(dǎo)致治療效果的增強(qiáng)。

使用設(shè)備

     
Micro CT（型號：Super Nova）（平生醫(yī)療科技）
 影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）