c-Fos蛋白在調(diào)控細(xì)胞病理生理過(guò)程中的作用及WB檢測(cè)時(shí)的注意事項(xiàng)
Fos超家族包括c-fos、fosB、fosL1和fosL2基因，這些基因編碼的亮氨酸拉鏈蛋白可以與Jun家族的蛋白二聚，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1（Activator Protein-1，AP-1）。AP-1結(jié)合 TPA 反應(yīng)元件和相關(guān)的 DNA 元件，如cAMP 反應(yīng)元件，從而調(diào)節(jié)一系列生理過(guò)程，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
圖1 c-Fos結(jié)構(gòu)
c-fos是Fos家族被發(fā)現(xiàn)最早和研究多的成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，c-fos 作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞的多種病理生理過(guò)程，和許多癌癥相關(guān)。c-fos的mRNA 和蛋白質(zhì)通常是在刺激后瞬時(shí)便開始了轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此被稱為即刻早期基因。
c-Fos的細(xì)胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)錄活性受到嚴(yán)格調(diào)控，特別是轉(zhuǎn)錄活性可以通過(guò)各種絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化來(lái)增強(qiáng)，包括MAPK p38、ERK1/2，以及ERK1/2活化的激酶Rsk1/2和IκB激酶對(duì)它的激活有效。c-Fos蛋白與細(xì)胞分化、增殖、存活以及受缺氧影響的組織穩(wěn)態(tài)以及血管生成等關(guān)鍵功能有關(guān)；c-Fos也可以對(duì)包括膠原酶I在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄起積極作用。
圖2 血清等因素刺激fos基因表達(dá)
那么，在用WB檢測(cè)c-Fos蛋白的時(shí)候，有哪些需要注意的條件呢？
01適當(dāng)?shù)靥幚砑せ頲-Fos的表達(dá)
c-Fos蛋白在某些組織中穩(wěn)定地表達(dá)，但受到不同的刺激時(shí)，在許多細(xì)胞中被快速瞬時(shí)誘導(dǎo)從而高度表達(dá)。在后一種情況下，c-Fos的積累在轉(zhuǎn)錄、mRNA周轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平上受到控制。血清、生長(zhǎng)因子、腫瘤促進(jìn)劑、細(xì)胞因子、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足和紫外線輻射等均會(huì)誘導(dǎo)c-Fos的表達(dá)。
a. 血清饑餓處理會(huì)抑制c-Fos的表達(dá)，添加FBS誘導(dǎo)可以促進(jìn)c-Fos表達(dá)。TPA或者PMA處理激活信號(hào)通路。
b. c-Fos易被泛素降解，可嘗試MG132處理，以激活蛋白表達(dá)和抑制蛋白體降解。
圖3 HeLa，NIH/3T3，PC-12，血清饑餓過(guò)夜（1，3，5）或PMA/NGF+ MG-132處理（2，4，6）后檢測(cè)c-Fos
02根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，提取核蛋白
當(dāng)受到特殊處理影響，c-Fos蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的定位不固定。在靜止細(xì)胞中，c-Fos以極少的量存在于胞質(zhì)溶膠中。細(xì)胞被刺激重新進(jìn)入生長(zhǎng)時(shí)，它經(jīng)歷兩波表達(dá)，第一波在FBS誘導(dǎo)后7.5分鐘達(dá)到峰值。在這個(gè)階段，蛋白質(zhì)是定位的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位需要Tyr-10和Tyr-30的去磷酸化。第二波表達(dá)發(fā)生在誘導(dǎo)后約20分鐘，并在1小時(shí)達(dá)到峰值。在這個(gè)階段，蛋白質(zhì)變成核定位。
圖4 血清刺激NIH-3T3細(xì)胞，c-fos在的SNF（可溶性核組分）中積累
03根據(jù)條帶趨勢(shì)分析辨認(rèn)c-Fos結(jié)果
c-fos基因編碼62kDa蛋白（380個(gè)氨基酸），存在多個(gè)剪切異構(gòu)體，最常見的剪切體分子量41kDa。c-Fos又可與強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun形成異二聚體，從而形成AP-1復(fù)合物。
研究表明，c-Fos蛋白可以在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間穿梭。進(jìn)入細(xì)胞核由至少兩種核定位信號(hào)控制：一種是最有可能利用核導(dǎo)入受體Impβ1的常規(guī)基本核定位信號(hào)，另一種是位于需要核導(dǎo)入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的蛋白質(zhì)N端部分的非常規(guī)核定位信號(hào)。有趣的是，這主要涉及單體c-Fos，并在與Jun蛋白異二聚時(shí)受到抑制。這表明二聚化是重要的，不僅對(duì)于活性AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，而且對(duì)于將它們保持在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用也是重要的，c-Fos/c-Jun復(fù)合體可影響細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，c-Fos的核保留率因其Jun合作伙伴而異，c-Jun比JunB或JunD更強(qiáng)，這與各種c-Fos-Jun二聚體的相互作用強(qiáng)度相關(guān)。
從上面幾張圖我們已經(jīng)可以發(fā)現(xiàn)，使用免疫原序列不同的抗體，即使是相同的細(xì)胞中，也可能識(shí)別c-Fos不同的異構(gòu)體。更為特殊的是，某些抗體識(shí)別c-Fos與c-Jun結(jié)合成的二聚體，它的實(shí)測(cè)分子量可能遠(yuǎn)不止41kDa或62kDa。
圖5 磷酸化c-Fos，二聚體表觀分子量約100kDa
部分相關(guān)產(chǎn)品：
參考文獻(xiàn)：
1. Nikoletta Szalóki，Jan Wolfgang Krieger，István Komáromi et al. Mol Cell Biol. （2015）35(21): 3785–3798
2. Hélène Gazon, Benoit Barbeau, Jean-Michel Mesnard et al. Hijacking of the AP-1 Signaling Pathway during Development of ATL. Frontiers in microbiology. (2018) 8:2686.
3. José María González, Ana Navarro-Puche, Berta Casar et al. Fast regulation of AP-1 activity through interaction of lamin A/C, ERK1/2, and c-Fos at the nuclear envelope. (2008) 183(4): 653–666.
4. Ce´cile E. Malnou, Fre´de´ rique Brockly, Cyril Favard et al. Heterodimerization with Different Jun Proteins Controls c-Fos Intranuclear Dynamics and Distribution. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. （2009）285（9）:6552–6562.
圖1 c-Fos結(jié)構(gòu)
c-fos是Fos家族被發(fā)現(xiàn)最早和研究多的成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，c-fos 作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞的多種病理生理過(guò)程，和許多癌癥相關(guān)。c-fos的mRNA 和蛋白質(zhì)通常是在刺激后瞬時(shí)便開始了轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此被稱為即刻早期基因。
c-Fos的細(xì)胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)錄活性受到嚴(yán)格調(diào)控，特別是轉(zhuǎn)錄活性可以通過(guò)各種絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化來(lái)增強(qiáng)，包括MAPK p38、ERK1/2，以及ERK1/2活化的激酶Rsk1/2和IκB激酶對(duì)它的激活有效。c-Fos蛋白與細(xì)胞分化、增殖、存活以及受缺氧影響的組織穩(wěn)態(tài)以及血管生成等關(guān)鍵功能有關(guān)；c-Fos也可以對(duì)包括膠原酶I在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄起積極作用。
圖2 血清等因素刺激fos基因表達(dá)
那么，在用WB檢測(cè)c-Fos蛋白的時(shí)候，有哪些需要注意的條件呢？
01適當(dāng)?shù)靥幚砑せ頲-Fos的表達(dá)
c-Fos蛋白在某些組織中穩(wěn)定地表達(dá)，但受到不同的刺激時(shí)，在許多細(xì)胞中被快速瞬時(shí)誘導(dǎo)從而高度表達(dá)。在后一種情況下，c-Fos的積累在轉(zhuǎn)錄、mRNA周轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平上受到控制。血清、生長(zhǎng)因子、腫瘤促進(jìn)劑、細(xì)胞因子、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足和紫外線輻射等均會(huì)誘導(dǎo)c-Fos的表達(dá)。
a. 血清饑餓處理會(huì)抑制c-Fos的表達(dá)，添加FBS誘導(dǎo)可以促進(jìn)c-Fos表達(dá)。TPA或者PMA處理激活信號(hào)通路。
b. c-Fos易被泛素降解，可嘗試MG132處理，以激活蛋白表達(dá)和抑制蛋白體降解。
圖3 HeLa，NIH/3T3，PC-12，血清饑餓過(guò)夜（1，3，5）或PMA/NGF+ MG-132處理（2，4，6）后檢測(cè)c-Fos
02根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，提取核蛋白
當(dāng)受到特殊處理影響，c-Fos蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的定位不固定。在靜止細(xì)胞中，c-Fos以極少的量存在于胞質(zhì)溶膠中。細(xì)胞被刺激重新進(jìn)入生長(zhǎng)時(shí)，它經(jīng)歷兩波表達(dá)，第一波在FBS誘導(dǎo)后7.5分鐘達(dá)到峰值。在這個(gè)階段，蛋白質(zhì)是定位的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位需要Tyr-10和Tyr-30的去磷酸化。第二波表達(dá)發(fā)生在誘導(dǎo)后約20分鐘，并在1小時(shí)達(dá)到峰值。在這個(gè)階段，蛋白質(zhì)變成核定位。
圖4 血清刺激NIH-3T3細(xì)胞，c-fos在的SNF（可溶性核組分）中積累
03根據(jù)條帶趨勢(shì)分析辨認(rèn)c-Fos結(jié)果
c-fos基因編碼62kDa蛋白（380個(gè)氨基酸），存在多個(gè)剪切異構(gòu)體，最常見的剪切體分子量41kDa。c-Fos又可與強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun形成異二聚體，從而形成AP-1復(fù)合物。
研究表明，c-Fos蛋白可以在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間穿梭。進(jìn)入細(xì)胞核由至少兩種核定位信號(hào)控制：一種是最有可能利用核導(dǎo)入受體Impβ1的常規(guī)基本核定位信號(hào)，另一種是位于需要核導(dǎo)入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的蛋白質(zhì)N端部分的非常規(guī)核定位信號(hào)。有趣的是，這主要涉及單體c-Fos，并在與Jun蛋白異二聚時(shí)受到抑制。這表明二聚化是重要的，不僅對(duì)于活性AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，而且對(duì)于將它們保持在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用也是重要的，c-Fos/c-Jun復(fù)合體可影響細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，c-Fos的核保留率因其Jun合作伙伴而異，c-Jun比JunB或JunD更強(qiáng)，這與各種c-Fos-Jun二聚體的相互作用強(qiáng)度相關(guān)。
從上面幾張圖我們已經(jīng)可以發(fā)現(xiàn)，使用免疫原序列不同的抗體，即使是相同的細(xì)胞中，也可能識(shí)別c-Fos不同的異構(gòu)體。更為特殊的是，某些抗體識(shí)別c-Fos與c-Jun結(jié)合成的二聚體，它的實(shí)測(cè)分子量可能遠(yuǎn)不止41kDa或62kDa。
圖5 磷酸化c-Fos，二聚體表觀分子量約100kDa
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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No |
Name |
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c-Fos 抗體 (E-8) |
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c-Fos 抗體 (D-1) |
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c-Fos 抗體 (6-2H-2F) |
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c-Fos 抗體 (C-10) |
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c-Fos (E2I7R) XP® Rabbit mAb |
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c-Fos (9F6) Rabbit mAb |
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c-Fos (E7L5L) Mouse mAb |
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c-Fos Antibody |
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MG-132 |
參考文獻(xiàn)：
1. Nikoletta Szalóki，Jan Wolfgang Krieger，István Komáromi et al. Mol Cell Biol. （2015）35(21): 3785–3798
2. Hélène Gazon, Benoit Barbeau, Jean-Michel Mesnard et al. Hijacking of the AP-1 Signaling Pathway during Development of ATL. Frontiers in microbiology. (2018) 8:2686.
3. José María González, Ana Navarro-Puche, Berta Casar et al. Fast regulation of AP-1 activity through interaction of lamin A/C, ERK1/2, and c-Fos at the nuclear envelope. (2008) 183(4): 653–666.
4. Ce´cile E. Malnou, Fre´de´ rique Brockly, Cyril Favard et al. Heterodimerization with Different Jun Proteins Controls c-Fos Intranuclear Dynamics and Distribution. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. （2009）285（9）:6552–6562.
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- Nutlin-3a(Rebemadlin)作為MDM2拮抗劑在動(dòng)物模型中的研究應(yīng)用
- TIANGEN質(zhì)粒大提解決方案的介紹及數(shù)據(jù)展示
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