Cell子刊文章分享：CAR-T/CAR-NK/CAR-M對膠質(zhì)母細胞瘤療效對比

文章來源公眾號：Chestnut Studying 作者：Chestnut

摘要
Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is a promising immunotherapy against cancer. Although there is a growing interest in other cell types, a comparison of CAR immune effector cells in challenging solid tumor contexts is lacking. Here, we compare mouse and human NKG2D-CAR-expressing T cells, natural killer (NK) cells, and macrophages against glioblastoma, the most aggressive primary brain tumor. In vitro we show that T cell cancer killing is CAR dependent, whereas intrinsic cytotoxicity overrules CAR dependence for NK cells, and CAR macrophages reduce glioma cells in co-culture assays. In orthotopic immunocompetent glioma mouse models, systemically administered CAR T cells demonstrate superior accumulation in the tumor, and each immune cell type induces distinct changes in the tumor microenvironment. An otherwise low therapeutic efficacy is significantly enhanced by co-expression of pro-inflammatory cytokines in all CAR immune effector cells, underscoring the necessity for multifaceted cell engineering strategies to overcome the immunosuppressive solid tumor microenvironment.

嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法是治療癌癥極具前景的免疫療法。盡管其他細胞類型的研究日益受到關(guān)注，但在復雜實體瘤環(huán)境中對CAR免疫效應細胞的比較研究仍顯不足。本研究通過小鼠與人類NKG2D-CAR表達T細胞、自然殺傷（NK）細胞及巨噬細胞對抗最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤——膠質(zhì)母細胞瘤，進行了系統(tǒng)比較。體外實驗表明：T細胞的抗癌殺傷能力依賴于CAR，而NK細胞的固有細胞毒性則超越了CAR依賴性；在共培養(yǎng)實驗中，CAR巨噬細胞可減少膠質(zhì)瘤細胞。在原位免疫功能正常膠質(zhì)瘤小鼠模型中，全身給藥的CAR T細胞在腫瘤組織中呈現(xiàn)顯著富集，且每種免疫細胞類型均誘導腫瘤微環(huán)境發(fā)生獨特改變。通過在所有CAR免疫效應細胞中共表達促炎性細胞因子，顯著提升了原本較低的治療效果，這強調(diào)了采用多維細胞工程策略克服免疫抑制性實體瘤微環(huán)境的必要性。



實驗結(jié)果1
利用 mRNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)可高效生成小鼠 CAR T 細胞、CAR NK 細胞和 CAR 巨噬細胞，并在體外顯示出不同的抗腫瘤活性

為了對小鼠 NKG2DCAR免疫效應細胞在同種異體正位免疫功能設置中的功能進行比較，關(guān)鍵是要生成足夠數(shù)量的小鼠免疫細胞，并確定一種可在每種細胞類型中進行可比CAR表達的系統(tǒng)。為了擴增原代免疫細胞亞群，作者采用了最近建立的小鼠 T 細胞、NK 細胞和骨髓來源巨噬細胞擴增方案，產(chǎn)生了足夠的細胞用于體內(nèi)收養(yǎng)性細胞轉(zhuǎn)移（圖 1A）。作者設計了表達 NKG2DCAR和報告蛋白 RQR8 的 mRNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和睡美人（SB）系統(tǒng)，它們通過 Furin/T2A 裂解位點分離。在Naive NKG2D 陽性的 T 細胞和NK 細胞中共同表達 RQR8 以量化轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導效率。在所有細胞類型中，只有 mRNA電穿孔顯示出高效和可比的轉(zhuǎn)染效率，且不妨礙細胞增殖。即使是慢病毒轉(zhuǎn)導也沒有提高 NK 細胞的轉(zhuǎn)染效率。

因此，mRNA轉(zhuǎn)染被證明是交叉比較不同CAR效應細胞的最佳系統(tǒng)。為了確定 mRNA 的表達動力學，作者生成了編碼熒光蛋白 ZsGreen 的 mRNA。流式細胞術(shù)顯示，用 ZsGreen mRNA電穿孔對所有免疫細胞類型的轉(zhuǎn)染效率幾乎達到 100%，而且在長達 5 天的時間里，80% 以上的細胞都能檢測到 ZsGreen（圖 1B-1D）。ZsGreen 的表達用顯微鏡進行了確認，從轉(zhuǎn)染后 2 小時開始，根據(jù)細胞類型的不同，在 7-12 小時后達到高峰（圖 1E）。除了編碼NKG2D-Furin/T2A-RQR8（CAR）的mRNA外，作者還設計了一個只編碼NKG2D腫瘤結(jié)合結(jié)構(gòu)域而不編碼細胞內(nèi)CD3ζ結(jié)構(gòu)域的功能對照（CARΔ(CD3ζ)）（圖1F）。

為了在體外評估不同CAR 免疫效應細胞的抗腫瘤潛力，作者用編碼 ZsGreen 的 mRNA 和編碼 CAR 或?qū)φ?CARΔ(CD3ζ) 的 mRNA 共同轉(zhuǎn)染它們，將它們與表達 tdTomato- 的 GL-261 細胞共同培養(yǎng)，并隨時間推移量化腫瘤匯合度。只有CAR T細胞能降低腫瘤細胞的匯合度，而與僅腫瘤細胞相比，CARΔ(CD3ζ) T細胞或模擬轉(zhuǎn)染的T細胞則沒有任何影響（圖1G）。NK 細胞介導的殺傷與CAR 表達無關(guān)，并顯示出快速動力學，共培養(yǎng) 8 小時后膠質(zhì)瘤細胞幾乎被完全消滅（圖 1H ）。表達 CAR 后，NK 細胞的殺傷力沒有提高，這讓作者不禁要問，這是 CAR 設計的原因，還是體外培養(yǎng)條件過度激活了 NK 細胞。作者用靶向淋巴瘤細胞CD19的第二代CD28-CD3ζ CAR 轉(zhuǎn)染 NK 細胞，對這一問題進行了研究。CD19CAR 的表達對靶細胞殺傷力的改善不大，而對 T 細胞的殺傷力則大幅提高。

這表明，其他 CAR 設計可能會增加 NK 細胞對膠質(zhì)瘤細胞的殺傷力。然而，在免疫抑制條件下，NKG2D表面表達下調(diào)，模擬轉(zhuǎn)染的 NK 細胞抗腫瘤活性降低，但 NKG2D CAR 表達保留了 NK 細胞的功能，證明了其功能益處。這促使作者在研究中繼續(xù)使用 NKG2D CAR。當表達 CAR 或 CARΔ(CD3ζ)時，巨噬細胞會隨著時間的推移降低腫瘤細胞的匯合度，但不會控制腫瘤生長（圖 1I）。巨噬細胞上 CAR 的表達有利于CD86的表達，CD86是一種已知的促炎巨噬細胞表型標記。與三種不同的膠質(zhì)瘤細胞系和兩種腦轉(zhuǎn)移細胞系共培養(yǎng)的流式細胞術(shù)證實了這些發(fā)現(xiàn)，并表明巨噬細胞減少了腫瘤細胞數(shù)量，但沒有使腫瘤細胞溶解（圖 1J、1 K）。主要組織相容性復合體I 類（MHC I 類）分子而非 NKG2D 配體 Rae-1 的表面表達與 NK 細胞介導的細胞系殺傷成反比。

實驗結(jié)果2
CAR T 細胞在體內(nèi)腫瘤中的蓄積能力更強

為了評估全身給藥的 CAR T 細胞、CAR NK 細胞和 CAR 巨噬細胞在正位、合成實體瘤環(huán)境中的腫瘤歸巢特性，作者使用體外三維顯微鏡觀察了 GL-261 膠質(zhì)瘤小鼠腦內(nèi)靜脈給藥熒光標記的 NKG2DCAR 免疫效應細胞的數(shù)量和空間分布。所有類型的被收養(yǎng)轉(zhuǎn)移的CAR免疫效應細胞主要位于高度血管化的腫瘤腫塊內(nèi)，而不是周圍的腦實質(zhì)內(nèi)（圖2A）。

與隨機模擬相比，對累積的 CAR 免疫效應細胞分布進行的詳細空間分析表明，CAR T 細胞（而非 CAR NK 細胞和 CAR 巨噬細胞）傾向于靠近血管結(jié)構(gòu)（圖 2B-2D）。每種處理后，每個腫瘤的相對血管體積相當。值得注意的是，CAR T 細胞和 NK 細胞均勻地分布在腫瘤的所有區(qū)域，而 CAR 巨噬細胞則聚集成團，腫瘤外圍區(qū)域幾乎沒有（圖 2E）。在不同的效應細胞中，CAR T 細胞的數(shù)量比 CAR NK 細胞或 CAR 巨噬細胞多（圖 2F）。為了證實三維顯微鏡分析，作者將轉(zhuǎn)染了 NKG2D CAR mRNA 的 CD45.1+ 免疫細胞靜脈注射到 CD45.2+患膠質(zhì)瘤的小鼠體內(nèi)，并使用體外流式細胞儀量化了腫瘤浸潤細胞的數(shù)量。

結(jié)果證實，CAR T 細胞比 CAR NK 細胞或 CAR 巨噬細胞數(shù)量更多（圖 2G）。由于細胞數(shù)量較少，作者還研究了局部瘤內(nèi)注射作為一種替代給藥途徑。與全身注射相比，這大大增加了所有 CAR 免疫效應細胞的瘤內(nèi)數(shù)量。瘤內(nèi)注射兩天后，CAR T 細胞和 CAR 巨噬細胞在腫瘤內(nèi)的存活率很高，而 CAR NK 細胞的存活率較低（圖 2H）。總之，這些結(jié)果表明，CAR T 細胞在靜脈給藥后具有最佳的腫瘤歸巢潛能，但一般來說，局部給藥途徑更適合將足夠的 CAR 效應細胞送到腫瘤部位。

實驗結(jié)果3
scRNA-seq鑒定腫瘤微環(huán)境中CAR T細胞、CAR NK細胞和CAR巨噬細胞療法的不同免疫特征

為了描述不同CAR效應細胞對腫瘤微環(huán)境的影響，作者在GL-261膠質(zhì)瘤小鼠體內(nèi)注射了CD45.1+ CAR T細胞、CAR NK細胞或CAR巨噬細胞，并在治療5天后使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析了CD45.2+腫瘤浸潤免疫細胞的分布情況。作者評估了通過質(zhì)量控制的每個樣本至少n= 6,499 個白細胞的單細胞 RNA圖譜。作者使用均勻流形近似和投影（UMAP）技術(shù)對結(jié)果中的n= 33,345 個細胞進行了可視化處理。

膠質(zhì)母細胞瘤中腫瘤浸潤免疫細胞的分布包括不同的髓系細胞群，包括單核細胞、一大群腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）和小膠質(zhì)細胞（圖 3A）。此外，作者還檢測到粒細胞、樹突狀細胞、NK 細胞、T 細胞和 B 細胞。不同的 CAR 免疫效應細胞導致了腫瘤免疫微環(huán)境的個體極化。CAR T細胞治療與更多的TAMs和粒細胞明顯相關(guān)。CAR NK細胞和CAR巨噬細胞的處理分別與更多的過渡性單核細胞或TAMs和NK細胞有關(guān)（圖3B和3C）。

T 細胞集群以及由單核細胞和 TAMs 組成的髓系細胞集群的基因本體富集分析進一步證實了這些不同的效應（圖 3D 和 3E）。CAR T細胞處理導致T細胞集群向細胞毒性狀態(tài)轉(zhuǎn)變，而對髓系細胞群的影響主要體現(xiàn)在代謝方面，并以糖酵解轉(zhuǎn)錄程序的變化為特征。CAR NK細胞和CAR巨噬細胞誘導了與抗病毒免疫防御相關(guān)的本體術(shù)語（圖3D）。CAR NK細胞和CAR巨噬細胞處理后，髓系細胞也出現(xiàn)了向抗病毒免疫反應的轉(zhuǎn)變（圖3E）。然而，對于 CAR 巨噬細胞來說，它似乎不是細胞自主的，而是通過 NK 細胞驅(qū)動的。

接下來，作者進一步分析了CAR免疫效應細胞處理對髓系細胞的不同影響，髓系細胞是膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中最大的免疫細胞亞群。為此，作者以經(jīng)典的Ly6chi單核細胞群作為最早的時間點進行了偽時間分析（圖 3F）。在已確定的轉(zhuǎn)錄連續(xù)體中，過渡性單核細胞之后是小膠質(zhì)細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序表達量不斷增加的 TAMs。對六個新興基因模塊中明顯富集基因的分析表明，早期 “偽 ”時間點與傷口愈合和抗病毒反應術(shù)語相關(guān)。中期時間點的特征是抗原處理相關(guān)基因和向巨噬細胞遷移過渡；晚期時間點則顯示脂質(zhì)代謝狀態(tài)（圖 3G）。各階段的豐度分析表明，對照組富集了中期和晚期階段相關(guān)基因表達模塊（圖 3H）。

同樣，CAR T 細胞治療與中期和晚期相關(guān)模塊 2 和 4 相關(guān)，而 CAR NK 細胞治療與早期和中期相關(guān)模塊 1、3 和 6 顯著相關(guān)。CAR 巨噬細胞治療顯示出模糊的特征，富集于早期階段模塊 3（與 CAR NK 細胞一起）和晚期階段模塊 4（與 CAR T 細胞一起）�？傊�，CAR T 細胞處理與髓系細胞的代謝重編程和晚期 TAMs 的出現(xiàn)有關(guān)，而 CAR NK 細胞處理則增加了過渡性單核細胞的豐度以及 T 細胞和髓系細胞的抗病毒反應。CAR 巨噬細胞處理顯示了兩者的特征。

實驗結(jié)果4
通過同時表達促炎細胞因子，可將 CAR 免疫效應細胞治療的有限生存益處轉(zhuǎn)化為治療效果

接下來，作者比較了不同 CAR 免疫效應細胞在體內(nèi)的治療潛力。為此，作者使用了完全免疫功能健全的合成膠質(zhì)瘤小鼠模型，并在腫瘤內(nèi)給予 CAR T 細胞、CAR NK 細胞或 CAR 巨噬細胞（圖 4A）。用模擬轉(zhuǎn)染的T細胞、NK細胞或巨噬細胞治療對小鼠的總體存活率影響有限，但沒有長期存活的小鼠（圖4B和4 C）。在所有 CAR 免疫效應細胞中，CAR T 細胞的表現(xiàn)最好。

然而，總體抗腫瘤活性仍然有限，GL-261 腫瘤小鼠只有一只長期存活，SB-28 腫瘤小鼠的中位存活率也只有提高，沒有長期存活（圖 4D 和 4E）。CAR T 細胞治療還伴隨著治療后兩天腫瘤內(nèi)最強的干擾素（IFN）γ 釋放，而血漿中的 IFNγ 濃度仍低于檢測限（圖 4F）。邊際存活效應與治療過程中 CAR細胞存活率的下降無關(guān)。術(shù)后存活的 CAR 免疫效應細胞保持了很高的存活率，并保留了體外抗腫瘤活性。每種 CAR 免疫效應細胞的各自優(yōu)勢促使人們探索它們的聯(lián)合用藥是否能在體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同效應。然而，事實并非如此，CAR T細胞、CAR NK細胞和CAR巨噬細胞的聯(lián)合應用提高了小鼠的中位總存活率，但并沒有提高長期存活小鼠的數(shù)量（圖4G）。為了克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，作者最近研究并證明，多功能 CAR T 細胞在轉(zhuǎn)染了編碼細胞因子 IL-12 和 IFNα2 的 mRNA 后，也能治愈神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠。

事實上，用每種多功能 CAR 免疫效應細胞治療都能提高小鼠的總體存活率，其中多功能 CAR NK 細胞表現(xiàn)最佳，能治愈 6 只神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠中的 4 只（圖 5A）。即使用只轉(zhuǎn)染了編碼細胞因子而沒有轉(zhuǎn)染 CAR 的 mRNA 的 T 細胞和 NK 細胞進行治療，也能提高患膠質(zhì)瘤小鼠的總體存活率。在攜帶侵襲性乳腺癌轉(zhuǎn)移細胞株 E0771-BrM 的小鼠中，CAR 免疫效應細胞中共同表達的細胞因子也能提高生存率（圖 5B）。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠中，細胞因子共表達顯示注射五天后 CAR T 細胞和 CAR NK 細胞數(shù)量增加。這與瘤內(nèi) IFNγ 的長期釋放和腫瘤相關(guān)髓系細胞的CD86上調(diào)有關(guān)（圖 5C、5 D）。同樣，CAR 巨噬細胞上的 CD86 表達也因細胞因子共表達和招募到腫瘤的 CD8α T 細胞數(shù)量增加而增加。

總體而言，治療耐受性良好，作為毒性間接指標的體重在多功能 CAR 和細胞因子表達免疫細胞治療過程中保持穩(wěn)定。血值評估顯示肌酐值不變，但天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和多功能 CAR 巨噬細胞的 IFNγ 值升高（圖 5F）。然而，組織學評估顯示，安樂死小鼠的肝臟和脾臟內(nèi)未出現(xiàn)與多功能 CAR 細胞給藥相關(guān)的明顯形態(tài)學變化。

實驗結(jié)果5
只有 CAR 淋巴細胞在體外和體內(nèi)對人類膠質(zhì)母細胞瘤具有活性

最后，作者的目標是確定在小鼠 CAR 效應細胞上觀察到的發(fā)現(xiàn)是否可以轉(zhuǎn)化為人類 CAR 免疫效應細胞。為此，作者制定了原代人 T 細胞、NK 細胞和巨噬細胞的擴增方案。在確認所有細胞類型的 mRNA 轉(zhuǎn)染效率高達 94% 以上后，作者使用粘附的人膠質(zhì)瘤細胞系 LN-229 和球形膠質(zhì)瘤啟動細胞系 ZH-161 進行了 24 小時殺傷試驗。與小鼠類似，表達 CARΔ（CD3ζ）的人 CAR T 細胞（而非對照組）能有效地裂解這兩種細胞系。

與此相反，只有在免疫抑制條件下表達 CAR 才能提高 NK 細胞的殺傷力，而免疫抑制條件會像小鼠一樣下調(diào) NKG2D 的表面表達（圖 6A）。與小鼠細胞相反，人類 NK 細胞介導的殺傷力與腫瘤細胞表面 MHC I 類分子的表達無關(guān)，但與 NKG2D 配體 MHC I 類多肽相關(guān)序列 A/B（MICA/B）相關(guān)。使用巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）從CD14+單核細胞分化出巨噬細胞，或使用促炎細胞因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和 IFNγ 極化巨噬細胞。M-CSF和GM-CSF/IFNγ都分化了CAR巨噬細胞，使膠質(zhì)瘤細胞減少達30%，而對照組表達CARΔ(CD3ζ)的巨噬細胞減少膠質(zhì)瘤細胞數(shù)量的程度較小（圖6B）。

接下來，作者用編碼 ZsGreen 的 mRNA 和編碼人 NKG2D CAR、人細胞因子（IL-12 和 IFNα2）或 CAR 和細胞因子的 mRNA 共同轉(zhuǎn)染人免疫細胞，并將它們與膠質(zhì)母細胞瘤患者樣本進行體外共同培養(yǎng)。24 小時后，作者使用基于圖像的單細胞平臺--藥理學鏡分析了膠質(zhì)母細胞瘤細胞的數(shù)量�？傮w而言，與 PBS 對照組相比，與人類淋巴細胞共同培養(yǎng)的腫瘤細胞數(shù)量明顯減少（圖 6C）。此外，作者還觀察到 CAR T 細胞和共表達細胞因子的 CAR T 細胞的抗膠質(zhì)母細胞瘤活性有所提高，這表現(xiàn)在腫瘤細胞分數(shù)降低和 T 細胞出現(xiàn)集群（圖 6C 和 6D）。此外，共同表達 CAR 和細胞因子還能顯著提高 NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷力。這些結(jié)果表明，在殺死膠質(zhì)母細胞瘤細胞方面，人 CAR 淋巴細胞優(yōu)于人 CAR 巨噬細胞，而且如果 CAR 淋巴細胞轉(zhuǎn)染后同時表達 IL-12 和 IFNα2，還能帶來抗腫瘤益處。