端粒酶檢測方法和應(yīng)用場景

2009年10月5日,美國科學家伊麗莎白·布萊克本、卡蘿爾·格雷德和杰克·紹斯塔克因“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的”,而獲得2009年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。端粒和端粒酶是當今生物界熱門的研究領(lǐng)域之一。研究端粒酶能揭示生物體胚胎早期發(fā)育、衰老和癌癥發(fā)生的機制。
 
一、端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)和功能
 
端粒(Telomere)是一種位于真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，能維持染色體末端穩(wěn)定，避免DNA發(fā)生降解、修飾、基因錯誤重組和丟失。端粒是一段結(jié)構(gòu)富含鳥嘌呤的DNA序列及與之結(jié)合的蛋白質(zhì)的復(fù)合體。端粒DNA由一系列串聯(lián)TTAGGG重復(fù)序列構(gòu)成,真核生物的端粒序列拷貝重復(fù)數(shù)目和長度因物種而異，長度約3~20kb不等。端粒的DNA序列呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)即D環(huán)--T環(huán)結(jié)構(gòu)。
 
端粒隨著細胞分裂的增加而逐漸磨損，長度縮短至臨界值時，細胞停止分裂進入衰老狀態(tài)，直至死亡。絕大多數(shù)端粒的長度隨分裂次數(shù)的增加而逐漸縮短。在一些少數(shù)細胞如生殖細胞、干細胞、癌細胞端粒長度保持不變。
 
端粒功能的維持主要由端粒酶 (Telomerase )完成。端粒酶是一種特異核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物逆轉(zhuǎn)錄酶，由互補于端粒DNA的RNA亞基、端粒酶催化亞基及端粒酶相關(guān)蛋白組成。人類細胞中主要由RNA模板(TER)，逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和輔助蛋白(TERP1)等三個組分構(gòu)成，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和功能，分子量約為500~1500KDa,其中hTERT能夠促進產(chǎn)生高活性端粒酶全酶,能夠利用自身的RNA模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒含有TTAGGG重復(fù)序列的DNA片段,在端粒酶活性及端粒長度維持中起到?jīng)Q定性作用。
 
端粒酶的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),進而影響細胞衰老與凋亡。端粒酶可以作為重要的靶點在對于癌癥的診斷、治療方面發(fā)揮作用。
 
正常人體細胞內(nèi)端粒酶蛋白表達和活性通常處于較低水平，因此每次分裂都會發(fā)生端粒(DNA)損耗性縮短,細胞進入衰老和凋亡階段。而癌細胞則可通過各種機制重新激活端粒酶來維持端粒延長，進而導(dǎo)致細胞不斷分裂、增殖。研究發(fā)現(xiàn)約有80%以上的癌變細胞能重新激活或上調(diào)端粒酶表達維持端粒(DNA)延伸。在正常人的體細胞中,端粒酶處于抑制的狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)在包括胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等大多數(shù)癌癥細胞中,端粒酶的活性明顯高于正常水平｡關(guān)于端粒酶又有新的分子功能發(fā)現(xiàn)，即端粒酶調(diào)控細胞重編程。
 
二、端粒酶檢測方法
 
端粒酶活性檢測在癌癥的診療等方面具有重大的研究意義｡如何準確､靈敏､快速地獲得端粒酶活性成為了在臨床診斷和治療方面的一大熱點｡
經(jīng)典的方法是基于鏈式聚合反應(yīng)(PCR)的端粒酶重復(fù)序列擴增技術(shù)(TRAPs)法，以后的很多關(guān)于端粒酶活性的研究方法均基于PCR技術(shù)提出,使得該方法在靈敏度和特異性方面取得了較大的提高。包括端粒重復(fù)擴增法(TRAP),TRAP-酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,TRAP-銀染法等等，化學反應(yīng)發(fā)光法、電化學法、熒光分析法、比色法等檢測方法相繼被開發(fā)｡
翼和生物開發(fā)的端粒酶檢測試劑盒能很好的完成端粒酶活性檢測。原理是：TERT被認為是端粒酶活性表達的關(guān)鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。 因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。具體是采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因GAPDH。通過提取細胞RNA，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應(yīng) (雙重探針：FAM、Cy5)。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達。
 
該試劑盒具有以下特點：
1 . 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2 . 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。
3 . 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。
4 . 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5.  定量： 以CT值判斷，可定量檢測。

三、端粒酶檢測應(yīng)用場景
 
端粒酶檢測可應(yīng)用于癌癥相關(guān)疾病風險評估和用于評估細胞狀態(tài)等多種場景，如：
 

1. 人源干細胞端粒酶活性排查
2. 判斷誘導(dǎo)分化是否完全
3. 樣本是否含有未分化種子細胞
4. 成瘤性評估
5. 種子細胞分化殘留檢測