一抗二抗選擇小技巧及不同實驗對抗體的要求

抗體 (Antibodies)，又稱為免疫球蛋白 (Immunoglobulin, Ig): 由 B 細(xì)胞增殖分化而來的漿細(xì)胞合成并分泌，能夠特異性識別與結(jié)合抗原。

 

 
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一抗: 指能跟目標(biāo)抗原特異性結(jié)合的蛋白，具有很高的特異性和親和力，因此被廣泛用于蛋白質(zhì)的檢測、純化和定量。

 
內(nèi)參/標(biāo)簽抗體：幫助您更準(zhǔn)確地檢測和鑒定蛋白質(zhì)，提高實驗的可靠性和一致性。

 
實驗驗證

內(nèi)源性免疫學(xué)驗證：

 
小分子抗體 ELISA 驗證：

 
客戶驗證

1.SIRT1 Antibody (HY-P80319)
J Inflamm Res. 2024 Mar 28:17:1971-1981. 樣本種屬: Human, Mouse; 應(yīng)用 WB, IF

 
2.RUNX2 Antibody (HY-P80445) +CaMKII alpha Antibody (HY-P80316)
Appl Mater Today. 2024 Feb, 36, 102026. 樣本種屬: Human; 應(yīng)用: IF

 
抗體選擇技巧

一抗選擇三要素：
1.目的蛋白：確認(rèn)研究的目的蛋白名稱 (核對 Gene ID)；
2.反應(yīng)種屬：抗體的反應(yīng)種屬 (Reactivity) 要包含待測樣本的種屬；
3.應(yīng)用：確認(rèn)抗體說明書上的應(yīng)用 (Application) 包含待做的實驗。

二抗選擇要點：
1.種屬來源：根據(jù)一抗種屬來源進(jìn)行選擇；如一抗宿主是小鼠來源，則二抗選擇抗小鼠的即可 (宿主來源于羊、兔等均可);
2.標(biāo)記物的選擇：根據(jù)實驗類型不同，來選擇二抗的偶聯(lián)標(biāo)記。

 
不同實驗對抗體有什么要求？

WB

WB 實驗中，蛋白質(zhì)在加熱條件下會發(fā)生變性。因此，WB 所使用的抗體需要能夠特異性地識別變性后蛋白質(zhì)的線性序列結(jié)構(gòu)。為了提高抗體的特異性，通常使用針對高特異性序列的合成多肽作為抗原進(jìn)行制備。

IP/ChIP

IP 實驗需要抗體能夠識別抗原的天然構(gòu)象，以便結(jié)合并沉淀抗原。因此，制備 IP 抗體時，最佳選擇是使用純化的天然蛋白或重組蛋白作為抗原來源。

ChIP 和 IP 原理上相似，但如果抗體識別的表位恰好是蛋白質(zhì)與 DNA 結(jié)合的部位可能會干擾結(jié)合，導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差或失敗。

IF/IHC

IF/IHC 實驗中，固定液里的化學(xué)物質(zhì)能夠穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性凝固。這種變性凝固一定程度改變了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。

但與 WB 變性不同，WB 中的加熱變性是通過高溫使蛋白質(zhì)完全變性，而在 IF 和 IHC 中變性程度較輕，蛋白質(zhì)仍然保持了一定的空間構(gòu)象，這一特性允許一些依賴于蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的抗體與之結(jié)合。

因此，在做 IF/IHC 實驗時，可以選擇純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體 (多肽需要在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面)。

FC

在 FC 實驗中，分為活細(xì)胞流式分析和經(jīng)過固定處理的流式分析兩種類型，它們對抗體的要求有所不同。

對于活細(xì)胞流式分析，最好使用針對天然蛋白或重組蛋白的抗體。這些抗體能夠識別活細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原，為活細(xì)胞提供準(zhǔn)確和可靠的信息。

對于經(jīng)過固定處理的流式分析，要求和 IF/IHC 實驗中所用的抗體一致。

抗體選擇 Q&A

Q: 我的抗體做 WB 非常好，可以做 IF, IHC 等其他任何實驗嗎？

A: 不一定，該抗體可能只針對蛋白質(zhì)的線性表位設(shè)計的，且用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì) 的內(nèi)部，可能只識別 WB 中線性的部分。

Q: 做 ChIP 的抗體是否可以用來做 WB 抗體？

A: 不一定，一般情況下多數(shù)能做 ChIP 的抗體都可以做 WB。但是如果 ChIP 的抗體識別的是構(gòu)象表位(比如是由兩個實際靠在一起但變?yōu)榫�性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠(yuǎn)的兩端序列)，而不是線性表位，這種 ChIP抗體做不了 WB。同理適用于 IP 的抗體不一定適用于 WB；適用于 IHC-P (抗原修復(fù)) 的不一定適用于IHC-F (不修復(fù))。

Q: 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項實驗怎么辦？

A: 一般而言，是沒有進(jìn)行驗證或驗證效果不佳，不建議直接用，可少量嘗試。
 
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