生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）殘留的檢測(cè)方法、法規(guī)與挑戰(zhàn)

一、HCPs
在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，宿主細(xì)胞扮演著關(guān)鍵的角色，是生產(chǎn)重組蛋白、抗體藥物或疫苗藥物等的重要起始材料。常見(jiàn)的宿主細(xì)胞類(lèi)型涵蓋了細(xì)菌細(xì)胞（如大腸桿菌）、酵母細(xì)胞（如釀酒酵母）以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞和人胚胎腎（HEK）細(xì)胞）等。

然而，作為生物制品中的非目標(biāo)成分，宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）的殘留問(wèn)題不容忽視。HCPs 主要包括宿主細(xì)胞分泌的蛋白以及因細(xì)胞凋亡、代謝產(chǎn)生的部分結(jié)構(gòu)蛋白。這些殘留的 HCPs 具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，一方面可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引發(fā)不良反應(yīng)；另一方面，某些具有酶活性的 HCPs 還可能影響終產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的組成，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性造成威脅。

因此，HCPs 被視為生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），在生物制品的成品和原液放行檢測(cè)以及中間產(chǎn)品的工藝控制中都需要重點(diǎn)關(guān)注。即便經(jīng)過(guò)復(fù)雜的純化工藝，最終的生物制品中仍可能殘留低濃度（1~100 ppm）的 HCPs，這凸顯了建立有效檢測(cè)方法的緊迫性。

二、法規(guī)引領(lǐng)
為確保生物制藥產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量，各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì) HCPs 的控制制定了多層次、多方面的法規(guī)要求。

從國(guó)際法規(guī)來(lái)看，美國(guó)藥典（USP）的 <1132> 章節(jié)明確規(guī)定，需采用靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的 HCP，其含量應(yīng)低于檢測(cè)限，通常小于 100ppm（即 1mg 總蛋白中 HCP 含量應(yīng)小于 100ng，也即 < 0.01%）。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的 Q6B 指南指出，要依據(jù) ICH 準(zhǔn)則，運(yùn)用敏感且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有效方法來(lái)監(jiān)控殘留的 HCP，其殘留量一般要求小于 100ppm。歐洲藥典（EP）在 2.6.34 中規(guī)定，生物制品中 HCP 的含量應(yīng)當(dāng)小于 0.1%。

中國(guó)藥典也對(duì)不同宿主細(xì)胞來(lái)源的生物制品中 HCP 殘留量做出了明確規(guī)定：CHO 細(xì)胞來(lái)源的生物制品，HCP 殘留需 < 0.05%（相當(dāng)于小于 500ppm）；E.coli 來(lái)源的，HCP 殘留需 < 0.01%（相當(dāng)于小于 100 ppm）；假單胞菌來(lái)源的，HCP 殘留需 < 0.02%（相當(dāng)于小于 200 ppm）。其他國(guó)家和地區(qū)的藥典也各自制定了相應(yīng)的 HCP 殘留標(biāo)準(zhǔn)，共同致力于保障生物制藥產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。制藥企業(yè)必須嚴(yán)格遵守這些法規(guī)要求，選擇合適的檢測(cè)方法和控制策略，確保 HCP 殘留量處于可接受的范圍之內(nèi)。

三、檢測(cè)手段
目前，測(cè)定生物制品中殘留 HCPs 的方法豐富多樣，主要可分為基于特異性抗體的方法和非免疫特異性方法。

（一）基于特異性抗體的方法
1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：作為目前 HCP 檢測(cè)最常用的方法，ELISA 利用抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)記的酶催化底物產(chǎn)生顏色變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì) HCPs 的檢測(cè)和定量。其優(yōu)點(diǎn)顯著，具有高靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)到低至 ng/mL 級(jí)別的 HCPs；操作相對(duì)簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模篩選且自動(dòng)化程度高；還可以提供精確的 HCPs 濃度數(shù)據(jù)。然而，ELISA 也存在一定的局限性，它高度依賴特定的抗體，抗體的制備和驗(yàn)證成本高且耗時(shí)；對(duì)于某些 HCPs 可能缺乏合適的抗體，導(dǎo)致漏檢；同時(shí)還可能存在抗體的交叉反應(yīng)，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。ELISA 主要應(yīng)用于工藝開(kāi)發(fā)中監(jiān)測(cè)不同工藝步驟的 HCPs 水平，以及作為最終產(chǎn)品放行的關(guān)鍵檢測(cè)方法，適用于需要高靈敏度和高通量的 HCPs 檢測(cè)場(chǎng)景。

2. 免疫印跡（Western Blot）：該方法先將 SDS-PAGE 分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo) HCPs，通過(guò)化學(xué)發(fā)光或顯色進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。免疫印跡的特異性高，能夠針對(duì)特定 HCPs 進(jìn)行檢測(cè)，并提供定性和相對(duì)定量信息。但它操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，適合小規(guī)模分析，且同樣依賴特異性抗體，抗體制備和驗(yàn)證成本高，靈敏度也受到檢測(cè)方法和抗體的限制。免疫印跡主要用于特定 HCPs 的檢測(cè)，以確認(rèn)和驗(yàn)證 ELISA 檢測(cè)結(jié)果，以及在研發(fā)階段對(duì)特定 HCPs 進(jìn)行深入研究。

（二）非免疫特異性方法
1. 質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry, MS）：質(zhì)譜通過(guò)電離樣品分子，并依據(jù)其質(zhì)量電荷比進(jìn)行分離和檢測(cè)，能夠提供 HCPs 的定性和定量信息。其優(yōu)點(diǎn)包括高靈敏度和分辨率，能檢測(cè)和區(qū)分多種 HCPs；無(wú)需特定抗體，適用于未知或新發(fā)現(xiàn)的 HCPs；還能提供分子量、氨基酸序列等詳細(xì)信息。但質(zhì)譜分析操作復(fù)雜，樣品制備和數(shù)據(jù)分析難度大，設(shè)備昂貴，需要高成本的儀器和技術(shù)支持，且分析時(shí)間長(zhǎng)，更適合小規(guī)模、詳細(xì)分析，不適用于高通量篩查。質(zhì)譜主要應(yīng)用于 HCPs 的鑒定，識(shí)別和定量復(fù)雜混合物中的 HCPs，以及在抗體開(kāi)發(fā)中確認(rèn)和驗(yàn)證 ELISA 抗體的靶標(biāo)。

2. SDS-PAGE 結(jié)合蛋白質(zhì)染色：此方法通過(guò) SDS-PAGE 將蛋白質(zhì)根據(jù)分子量分離，然后用染料（如考馬斯亮藍(lán)或銀染）進(jìn)行染色，以檢測(cè) HCPs 的總量和分布。它操作簡(jiǎn)單、成本低、設(shè)備要求低，能夠直觀可視化 HCPs 的分布和相對(duì)濃度。但該方法靈敏度低，僅能檢測(cè)較高濃度的 HCPs（μg/mL 級(jí)別），難以提供精確的 HCPs 濃度，分辨率也有限，難以區(qū)分分子量相近的 HCPs。主要適用于初步篩選，快速評(píng)估 HCPs 的總量和大致分布，以及工藝監(jiān)控中用于工藝優(yōu)化和不同批次之間的比較。

3. 毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）：CE 通過(guò)毛細(xì)管內(nèi)的電場(chǎng)分離蛋白質(zhì)，依據(jù)電泳遷移率差異檢測(cè) HCPs。它具有高分辨率，能精確分離不同 HCPs，自動(dòng)化程度高，適合高通量分析。但設(shè)備昂貴，需要高成本的設(shè)備和維護(hù)，技術(shù)要求高，樣品制備復(fù)雜，分析時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)某些 HCPs 可能靈敏度不夠。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中進(jìn)行詳細(xì)的 HCPs 分析，以及工藝優(yōu)化中用于監(jiān)控生物制品生產(chǎn)過(guò)程。

4. 高效液相色譜（HPLC）：HPLC 通過(guò)液相色譜柱分離 HCPs，根據(jù)不同的保留時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)和定量。它具有高靈敏度和分辨率，能分離和定量不同 HCPs，自動(dòng)化程度高，適合定量分析。但設(shè)備昂貴，需要高成本的儀器和技術(shù)支持，樣品制備復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，分析速度較慢，且需要結(jié)合其他檢測(cè)手段（如 MS）才能準(zhǔn)確識(shí)別 HCPs。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中進(jìn)行詳細(xì)的 HCPs 分析和定量，以及研發(fā)階段用于優(yōu)化和監(jiān)控生物制品生產(chǎn)過(guò)程。

5. 多種技術(shù)結(jié)合（如 ELISA 與 MS 結(jié)合）：綜合利用 ELISA 和質(zhì)譜等方法的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行 HCPs 的檢測(cè)和分析，能夠提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，提供更全面的 HCPs 信息。但操作復(fù)雜，需要多種設(shè)備和技術(shù)支持，時(shí)間和成本增加，技術(shù)要求高，需要多種技術(shù)人員的協(xié)同工作。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中確保最終產(chǎn)品的 HCPs 水平符合標(biāo)準(zhǔn)，以及工藝優(yōu)化中用于工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化階段的全面 HCPs 分析。

四、未來(lái)展望
盡管 ELISA 是目前 HCPs 殘留的主要質(zhì)控方法，但它存在諸多局限性。其準(zhǔn)確性高度依賴抗體的特異性，無(wú)法獲得 HCPs 的種類(lèi)及其含量分布信息，需要使用正交方法進(jìn)行全面監(jiān)測(cè)。例如，商業(yè)化的 HCP ELISA 試劑盒抗體特異性和適用性低，容易出現(xiàn)漏檢，且更換批次時(shí)需再次驗(yàn)證。在單克隆抗體藥物生產(chǎn)中，HCPs 殘留可被蛋白 A 有效去除，但在基因治療藥物（如 AAV 和溶酶病毒等）生產(chǎn)中，缺乏相應(yīng)的 HCPs 去除工藝，因此對(duì)于某些生物制品，結(jié)合多種檢測(cè)方法分析和檢測(cè) HCPs 殘留顯得尤為重要。

為彌補(bǔ) ELISA 的不足，液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）逐漸成為一種高通量、高靈敏度檢測(cè) HCPs 殘留的方法。質(zhì)譜法可在單次實(shí)驗(yàn)中鑒定和定量多種 HCPs，不存在抗體法對(duì)無(wú)親和力或低親和力 HCPs 的歧視，可應(yīng)用于生物制品全生命周期的 HCPs 監(jiān)控。此外，對(duì)于缺乏商品化 ELISA 試劑盒的宿主細(xì)胞，LC-MS 法的開(kāi)發(fā)周期短，可在 1 個(gè)月內(nèi)完成，能快速應(yīng)用于殘留 HCPs 的檢測(cè)。

2023 年 5 月，美國(guó)藥典發(fā)布的 “質(zhì)譜法測(cè)定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白”(征求意見(jiàn)稿)，進(jìn)一步推動(dòng)和規(guī)范了 LC-MS 法在 HCP 分析檢測(cè)中的應(yīng)用，為未來(lái) HCPs 檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展指明了方向。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信在 HCPs 檢測(cè)領(lǐng)域?qū)��?huì)取得更多的突破，為生物制品的質(zhì)量和安全提供更有力的保障。

產(chǎn)品信息


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