融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽的種類及各自的作用

蛋白質(zhì)標(biāo)簽技術(shù)是通過基因重組方法，將具有特定功能的多肽序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或完整功能蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)的技術(shù)體系。該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)、便捷純化、精準(zhǔn)檢測和動(dòng)態(tài)追蹤等功能，已成為現(xiàn)代蛋白質(zhì)研究中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)�；�于親和層析原理，融合標(biāo)簽?zāi)軌蚺c特定層析介質(zhì)發(fā)生高特異性結(jié)合，從而快速獲得高純度、高產(chǎn)量的目標(biāo)蛋白，極大推動(dòng)了蛋白質(zhì)研究的標(biāo)準(zhǔn)化和高效化進(jìn)程。

一、純化標(biāo)簽

His 標(biāo)簽
His 標(biāo)簽由六個(gè)組氨酸殘基組成，是當(dāng)前最為流行的標(biāo)簽蛋白。其分子量僅約 0.84KD，這使其在融合后幾乎不會(huì)對目標(biāo)蛋白的功能造成干擾。無論是在非離子型表面活性劑存在的溫和條件下，還是在用于處理包涵體蛋白的變性環(huán)境中，His 標(biāo)簽融合蛋白都能游刃有余地進(jìn)行純化。組氨酸殘基側(cè)鏈對固態(tài)鎳的強(qiáng)烈吸引力，讓固定化金屬螯合層析（IMAC）成為純化重組蛋白的得力手段。His 標(biāo)簽不僅在蛋白純化方面表現(xiàn)出色，還在蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì) - DNA 相互作用研究中嶄露頭角。同時(shí)，其相對較低的免疫原性，使得將純化蛋白直接用于動(dòng)物免疫制備抗體成為可能。此外，His 標(biāo)簽還具備良好的兼容性，可與其他親和標(biāo)簽攜手構(gòu)建雙親和標(biāo)簽，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用范圍。

GST 標(biāo)簽
GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽蛋白，其天然大小為 26KD。一方面，它具有高度的可溶性，能夠顯著提升外源蛋白在大腸桿菌中的溶解能力，有效避免蛋白因不溶而形成包涵體；另一方面，它在大腸桿菌中能夠大量表達(dá)，為提高目的蛋白的表達(dá)量立下汗馬功勞。GST 標(biāo)簽融合蛋白在非變性條件下，可輕松借助 10mM 還原型谷胱甘肽進(jìn)行洗脫，且多數(shù)情況下在水溶液中能保持可溶狀態(tài)并形成二聚體。這種特性使得 GST 標(biāo)簽蛋白的純化過程相對溫和，能夠較好地保留蛋白的抗原性和生物活性。需要注意的是，由于 GST 在變性條件下會(huì)失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此在純化緩沖液中不可加入強(qiáng)變性劑。若要去除 GST 融合部分，可采用位點(diǎn)特異性蛋白酶進(jìn)行切割。

MBP 標(biāo)簽
MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為 40kDa，由大腸桿菌 K12 的 malE 基因編碼。它能夠有效增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白，尤其是真核蛋白的溶解性。MBP 標(biāo)簽可通過免疫分析方便地進(jìn)行檢測，并且其融合位置十分靈活，既可以位于蛋白的 N 端，也能融合在 C 端。在純化過程中，融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步完成純化，結(jié)合的融合蛋白只需用 10mM 麥芽糖在生理緩沖液中洗脫即可。不過，需要留意的是，一些融合蛋白在 0.2% Triton X - 100 或 0.25% Tween 20 存在下可能無法有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受此影響。此外，緩沖條件需控制在 pH7.0 到 8.5，鹽濃度可高達(dá) 1M，但同樣不能使用變性劑。若要去除 MBP 融合部分，同樣可借助位點(diǎn)特異性蛋白酶進(jìn)行切除。

FLAG 標(biāo)簽
FLAG 標(biāo)簽蛋白由 8 個(gè)氨基酸（DYKDDDDK）組成，載體中構(gòu)建的 Kozak 序列，使得帶有 FLAG 的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中能夠高效表達(dá)。FLAG 標(biāo)簽具有諸多優(yōu)點(diǎn)，它通常不會(huì)與目的蛋白發(fā)生相互作用，也不會(huì)影響目的蛋白的功能與性質(zhì)。融合 FLAG 的目的蛋白可直接通過 FLAG 進(jìn)行親和層析，這種非變性純化方式能夠有效純化有活性的融合蛋白，且純化效率極高。同時(shí)，F(xiàn)LAG 標(biāo)簽還能被抗 FLAG 的抗體精準(zhǔn)識(shí)別，這為通過 Western Blot、ELISA 等方法對含有 FLAG 的融合蛋白進(jìn)行檢測與鑒定提供了極大的便利。更為出色的是，融合在 N 端的 FLAG 可被腸激酶切除（DDDK），從而輕松獲得特異的目的蛋白。

Avi 標(biāo)簽
AviTag 標(biāo)簽蛋白是一個(gè)由 15 個(gè)氨基酸組成的短肽，它擁有一個(gè)獨(dú)特的單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，且與已知天然可生物素化序列截然不同。無論是在體外還是體內(nèi)環(huán)境中，幾乎所有的蛋白都能在這個(gè)獨(dú)特的 Avi Tag 位點(diǎn)輕易且高效地被生物素化。生物素化過程通過酶和底物的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)條件溫和且標(biāo)記專一性極高。AviTag 標(biāo)簽的分子量極小，僅有 15 個(gè)氨基酸，這使得它對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響微乎其微。在純化重組蛋白時(shí)，可選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，從而實(shí)現(xiàn)對融合蛋白的有效分離與純化。

SUMO 標(biāo)簽
SUMO 標(biāo)簽蛋白屬于小分子泛素樣修飾蛋白家族，盡管在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與泛素僅有 18% 的同源性，但兩者在三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上卻極為相似。SUMO 標(biāo)簽不僅能夠顯著提高融合蛋白的表達(dá)量，還具備抗蛋白酶水解的能力，能夠有效保護(hù)靶蛋白不被降解。同時(shí)，SUMO 標(biāo)簽還能促進(jìn)靶蛋白的正確折疊，提高重組蛋白的可溶性，為后續(xù)的蛋白研究與應(yīng)用提供了更優(yōu)質(zhì)的材料。

Halo Tag
HaloTag 標(biāo)簽蛋白是一種經(jīng)過遺傳修飾的脫鹵素酶衍生物，分子量為 33KDa，可與多種合成的 HaloTag 配基高效地共價(jià)結(jié)合。HaloTag 標(biāo)簽?zāi)軌蛉诤显谥亟M蛋白的 N 端或 C 端，并且在原核和真核系統(tǒng)中均能順利表達(dá)。HaloTag 配基作為小分子化學(xué)物，無論是在體外還是體內(nèi)環(huán)境下，都能與 HaloTag 蛋白緊密共價(jià)結(jié)合。這種獨(dú)特的共價(jià)結(jié)合特性，使得 HaloTag 標(biāo)簽在蛋白純化和標(biāo)記等方面展現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢，為科研人員提供了一種高效、穩(wěn)定的蛋白處理工具。

SNAP Tag
SNAP Tag 作為新一代的蛋白標(biāo)簽技術(shù)，以其極高的專一性和出色的穩(wěn)定性脫穎而出。它的最大亮點(diǎn)在于能夠適用于多種復(fù)雜環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測與純化，無論是在活細(xì)胞內(nèi)、溶液中，還是在固態(tài)相（如 SDS - PAGE gels）中，都能大顯身手。SNAP Tag 源于人的 O6 - 甲基鳥嘌呤 - DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，其與底物的結(jié)合具有高度特異性。在反應(yīng)過程中，SNAP Tag 所帶的活性巰基位點(diǎn)會(huì)與苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，釋放出鳥嘌呤，從而使目的蛋白攜帶上苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。

由于苯甲基鳥嘌呤在生化條件下極為穩(wěn)定，且不會(huì)與其他蛋白發(fā)生作用，因此 SNAP 標(biāo)簽反應(yīng)具有極高的特異性。在純化過程中，只需將純化的或未純化的 SNAP - Tag 融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質(zhì)混合，蛋白即可特異性地與底物作用，形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的固定與純化，為蛋白研究與應(yīng)用帶來了極大的便利。

二、報(bào)告標(biāo)簽

c - Myc 標(biāo)簽
c - Myc 標(biāo)簽蛋白由 11 個(gè)氨基酸組成，其標(biāo)簽序列 Glu - Gln - Lys - Leu - Ile - Ser - Glu - Glu - Asp - Leu，作為抗原表位，即便表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中，也能被相應(yīng)抗體精準(zhǔn)識(shí)別。在科研領(lǐng)域，c - Myc tag 已在 Western - blot 雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)等方面得到廣泛應(yīng)用，成為檢測重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中表達(dá)情況的得力工具。憑借其高靈敏度和特異性，c - Myc 標(biāo)簽?zāi)軌驗(yàn)榭蒲腥藛T提供準(zhǔn)確的蛋白表達(dá)信息，助力深入探究蛋白的功能與作用機(jī)制。

HA 標(biāo)簽
HA 標(biāo)簽蛋白的標(biāo)簽序列 YPYDVPDYA，源自流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，僅有 9 個(gè)氨基酸。這個(gè)小巧的標(biāo)簽具有獨(dú)特的優(yōu)勢，它對外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響極小，能夠輕松構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白并融合到 N 端或者 C 端。在檢測方面，常用 Anti－HA 抗體檢測和 ELISA 檢測對其進(jìn)行分析。HA 標(biāo)簽的存在，為蛋白的檢測與鑒定提供了一種簡單、有效的途徑，在生物藥研發(fā)過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。

熒光素酶
熒光素酶來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和 Guassia 熒光素酶。與普通融合蛋白標(biāo)簽不同，熒光素酶構(gòu)建的報(bào)告基因宛如一把精準(zhǔn)的尺子，可用作目的基因的定量分析。在分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。其具有諸多顯著優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高，能夠檢測到極微量的目的基因表達(dá)；檢測幅度寬，可適應(yīng)不同水平的基因表達(dá)變化；由于不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性基因，避免了內(nèi)源性干擾；重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠；并且與 HTS（高通量篩選）技術(shù)高度兼容，能夠滿足大規(guī)模藥物篩選等實(shí)驗(yàn)需求。螢火蟲和海腎熒光素酶因其來源不同、蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異大，在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)相互影響，已被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報(bào)告并進(jìn)行均一化研究，為基因表達(dá)調(diào)控、啟動(dòng)子功能研究等提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

熒光標(biāo)簽蛋白
熒光標(biāo)簽蛋白家族，如 eGFP/eCFP/eYFP/eCherry 等，各具獨(dú)特的激發(fā)波長和發(fā)射波長，它們均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。以 eGFP 為例，相較于 GFP，其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，熒光性質(zhì)也更加穩(wěn)定。同時(shí)，載體中構(gòu)建的 Kozak 序列使得含有 eGFP 的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中能夠高效表達(dá)。mCherry 作為從 DsRed 演化而來的優(yōu)秀單體紅色熒光蛋白，在 N 端和 C 端融合外源蛋白時(shí)，對熒光蛋白活性和目標(biāo)蛋白功能幾乎沒有明顯影響。這些熒光標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)目的蛋白后，無需破碎組織細(xì)胞，也無需添加任何底物，只需借助熒光顯微鏡，就能在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)發(fā)出明亮的熒光，清晰地顯示目的基因的表達(dá)情況，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被譽(yù)為活細(xì)胞探針。通過熒光標(biāo)簽蛋白，科研人員能夠直觀地觀察目的蛋白在細(xì)胞中的定位、遷移變化等動(dòng)態(tài)過程，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的其他產(chǎn)物不會(huì)干擾其檢測，使得檢測過程更加快速、簡便、靈敏且重現(xiàn)性好。

此外，其低消耗、高靈敏度的特點(diǎn)，使其十分適用于高通量的藥物篩選。因此，熒光標(biāo)簽蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白功能定位等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為生物藥研發(fā)和生命科學(xué)研究注入了強(qiáng)大的活力。在病毒研究方面，mCherry 紅色熒光蛋白更是展現(xiàn)出得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，例如用 mRFP 或 mCherry 標(biāo)記 HIV 病毒顆粒，能夠深入研究 HIV 與宿主細(xì)胞之間的相互作用，為攻克艾滋病等相關(guān)疾病提供了有力的研究手段。

產(chǎn)品信息


杭州斯達(dá)特 (www.starter-bio.com)志在為全球生命科學(xué)行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的抗體、蛋白、試劑盒等產(chǎn)品及研發(fā)服務(wù)。依托多個(gè)開發(fā)平臺(tái)：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發(fā)平臺(tái)（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過歐盟98/79/EC認(rèn)證、ISO9001認(rèn)證、ISO13485。