ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本收集及稀釋處理詳述
用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本有多種類型，包括血清和血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法存在差異。合適的樣本預(yù)處理，是確保ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的第一步。下面介紹幾種不同樣本類型的處理方法：
常規(guī)樣本處理方式：
血液樣本
血液樣本分為全血、血漿、血清三種。簡(jiǎn)單描述：
全血：全血=血漿+血細(xì)胞。
血漿：全血加抗凝劑后離心分離出來(lái)的淡黃色液體是血漿。
血清：全血不加抗凝劑而自然凝固后分離出來(lái)的，不含纖維蛋白原的淡黃色液體是血清。
血液樣本是ELISA/液相實(shí)驗(yàn)最常用的樣本。在收集血液樣本的過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另外，樣本還需要避免細(xì)菌污染，因?yàn)槠淇赡軙?huì)導(dǎo)致樣本含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。且要避免使用高血脂樣本。脂質(zhì)會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合，從而影響測(cè)值的準(zhǔn)確性。
1.血清和血漿
血清是ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。
① 使用無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置1小時(shí)或2-8℃過(guò)夜，分離出血清；
② 2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，小心收集上層血清。
血漿樣本
① 使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃條件下，以1000×g離心15分鐘，小心收集上層血漿；
② 常見的抗凝劑包括：EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。
2.細(xì)胞培養(yǎng)上清
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液。
3.細(xì)胞裂解液
① 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，再加入適量的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈（懸浮細(xì)胞可以省略該步驟）；
② 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心5分鐘，再吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次；
③ 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑），重懸細(xì)胞。添加比例：約1×106個(gè)細(xì)胞加入150-250μL PBS重懸細(xì)胞；
④ 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可使用超聲波細(xì)胞破碎器，超聲處理懸浮液來(lái)裂解細(xì)胞；
⑤ 2-8℃條件下，以1500×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。
4.組織勻漿
① 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織，除去表面殘留的血液或雜質(zhì)；
② 將組織塊稱重，再切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿；
③ 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g組織樣品對(duì)應(yīng)9mL PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融；
④ 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃條件下，以5000×g離心5分鐘，收集上清液。
5.腦脊液
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取適量上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
大鼠腦脊液采集方法：采集腦脊液時(shí)，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1.5cm 左右)，在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開 2cm，將皮分離兩側(cè)，擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭 骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。注意，有出血時(shí)用干紗 布按壓止血，保持術(shù)口清晰。接近頸后黃韌帶時(shí)，小心地用 7 號(hào)注射針頭分離覆 蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成 150 度鈍 角)，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液， 一般采集量為 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打開腹腔，另取10mL注射器進(jìn)行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。
② 在冰面上對(duì)肺進(jìn)行肺灌洗。取37℃生理鹽水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用無(wú)菌管收集肺泡灌洗液后1000xg離心10min，離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃或-80℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融，如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
樣本保存方法：
樣品收集后，若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可保存于2-8℃的環(huán)境中；若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）或-80℃（3個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）的環(huán)境中，避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)前，建議再次離心，去除沉淀物。
注意事項(xiàng)：
1、試劑盒的檢測(cè)范圍不等同于樣本的濃度范圍。如果樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議查閱文獻(xiàn)，并做預(yù)實(shí)驗(yàn)）。
2、收集組織與細(xì)胞提取液樣本時(shí)，不建議使用商品化的裂解試劑。裂解試劑中的成分，可能會(huì)影響抗原抗體結(jié)合，或造成基質(zhì)干擾，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作，三者缺一不可。在操作過(guò)程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問(wèn)題，需要進(jìn)行樣本稀釋。
一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍的，一般有這幾種情況。
樣本值高的可能情況:
1、樣本中待測(cè)物含量過(guò)高。一些高豐度蛋白來(lái)說(shuō)，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。
2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后，大量表達(dá)胰島素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。
4、疫苗原性研究時(shí)，注射疫苗的小鼠，會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產(chǎn)物，單克隆抗體純品等。
二.如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)呢？樣本稀釋的原則如下：
在查詢背景知識(shí)，或者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了樣本濃度過(guò)高，需要進(jìn)行稀釋，就要根據(jù)以下原則，嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。
1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測(cè)定的OD值，要求落在標(biāo)準(zhǔn)品最高值OD值的半量程內(nèi)，假定標(biāo)準(zhǔn)品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個(gè)范圍附近，計(jì)算的濃度值最為準(zhǔn)確，以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，得到的樣本濃度最準(zhǔn)確。
2、稀釋過(guò)程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過(guò)程中，誤差越大。
三、在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題：
樣本測(cè)定OD值超過(guò)標(biāo)曲最高點(diǎn)OD值，造成測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋，如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)？咱們先了解下 樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些？
1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏小。
2、過(guò)度稀釋。過(guò)度稀釋時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏大。
3、稀釋不夠規(guī)范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范，特別是大比例稀釋時(shí)，人為偏差大大增加。
常規(guī)樣本處理方式：
血液樣本
血液樣本分為全血、血漿、血清三種。簡(jiǎn)單描述：
全血：全血=血漿+血細(xì)胞。
血漿：全血加抗凝劑后離心分離出來(lái)的淡黃色液體是血漿。
血清：全血不加抗凝劑而自然凝固后分離出來(lái)的，不含纖維蛋白原的淡黃色液體是血清。
血液樣本是ELISA/液相實(shí)驗(yàn)最常用的樣本。在收集血液樣本的過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另外，樣本還需要避免細(xì)菌污染，因?yàn)槠淇赡軙?huì)導(dǎo)致樣本含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。且要避免使用高血脂樣本。脂質(zhì)會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合，從而影響測(cè)值的準(zhǔn)確性。
1.血清和血漿
血清是ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。
① 使用無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置1小時(shí)或2-8℃過(guò)夜，分離出血清；
② 2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，小心收集上層血清。
血漿樣本
① 使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃條件下，以1000×g離心15分鐘，小心收集上層血漿；
② 常見的抗凝劑包括：EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。
2.細(xì)胞培養(yǎng)上清
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液。
3.細(xì)胞裂解液
① 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，再加入適量的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈（懸浮細(xì)胞可以省略該步驟）；
② 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心5分鐘，再吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次；
③ 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑），重懸細(xì)胞。添加比例：約1×106個(gè)細(xì)胞加入150-250μL PBS重懸細(xì)胞；
④ 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可使用超聲波細(xì)胞破碎器，超聲處理懸浮液來(lái)裂解細(xì)胞；
⑤ 2-8℃條件下，以1500×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。
4.組織勻漿
① 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織，除去表面殘留的血液或雜質(zhì)；
② 將組織塊稱重，再切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿；
③ 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g組織樣品對(duì)應(yīng)9mL PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融；
④ 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃條件下，以5000×g離心5分鐘，收集上清液。
5.腦脊液
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取適量上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
大鼠腦脊液采集方法：采集腦脊液時(shí)，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1.5cm 左右)，在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開 2cm，將皮分離兩側(cè)，擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭 骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。注意，有出血時(shí)用干紗 布按壓止血，保持術(shù)口清晰。接近頸后黃韌帶時(shí)，小心地用 7 號(hào)注射針頭分離覆 蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成 150 度鈍 角)，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液， 一般采集量為 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打開腹腔，另取10mL注射器進(jìn)行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。
② 在冰面上對(duì)肺進(jìn)行肺灌洗。取37℃生理鹽水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用無(wú)菌管收集肺泡灌洗液后1000xg離心10min，離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃或-80℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融，如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
樣本保存方法：
樣品收集后，若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可保存于2-8℃的環(huán)境中；若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）或-80℃（3個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）的環(huán)境中，避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)前，建議再次離心，去除沉淀物。
注意事項(xiàng)：
1、試劑盒的檢測(cè)范圍不等同于樣本的濃度范圍。如果樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議查閱文獻(xiàn)，并做預(yù)實(shí)驗(yàn)）。
2、收集組織與細(xì)胞提取液樣本時(shí)，不建議使用商品化的裂解試劑。裂解試劑中的成分，可能會(huì)影響抗原抗體結(jié)合，或造成基質(zhì)干擾，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作，三者缺一不可。在操作過(guò)程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問(wèn)題，需要進(jìn)行樣本稀釋。
一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍的，一般有這幾種情況。
樣本值高的可能情況:
1、樣本中待測(cè)物含量過(guò)高。一些高豐度蛋白來(lái)說(shuō)，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。
2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后，大量表達(dá)胰島素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。
4、疫苗原性研究時(shí)，注射疫苗的小鼠，會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產(chǎn)物，單克隆抗體純品等。
二.如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)呢？樣本稀釋的原則如下：
在查詢背景知識(shí)，或者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了樣本濃度過(guò)高，需要進(jìn)行稀釋，就要根據(jù)以下原則，嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。
1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測(cè)定的OD值，要求落在標(biāo)準(zhǔn)品最高值OD值的半量程內(nèi)，假定標(biāo)準(zhǔn)品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個(gè)范圍附近，計(jì)算的濃度值最為準(zhǔn)確，以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，得到的樣本濃度最準(zhǔn)確。
2、稀釋過(guò)程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過(guò)程中，誤差越大。
三、在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題：
樣本測(cè)定OD值超過(guò)標(biāo)曲最高點(diǎn)OD值，造成測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋，如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)？咱們先了解下 樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些？
1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏小。
2、過(guò)度稀釋。過(guò)度稀釋時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏大。
3、稀釋不夠規(guī)范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范，特別是大比例稀釋時(shí)，人為偏差大大增加。
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