關(guān)于RNA降解詳細(xì)介紹
RNA抽取一般使用Trizol法抽提：
Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進(jìn)行提取組織或細(xì)胞中的RNA。
Trizol作用原理:
在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入lv仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。
水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。
接下來了解RNA提取中RNA降解原因：
一、RNA降解原因：
1 、 新鮮細(xì)胞：
裂解液的量不足，使得裂解不充分。
2 、 新鮮組織：
某些含有內(nèi)源性核酸酶的樣品，很難避免RNA酶的降解，建議采用的方法為在液氮條件下將組織研碎，并且，勻漿時采用更多的裂解液。
3 、冷凍樣品：
樣品取材后應(yīng)該迅速置于液氮中冷凍存放，然后轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放。如果未經(jīng)液氮速冷直接轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放，會造成RNA緩慢降解。樣品研磨后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
4 、內(nèi)源 RNA 酶的污染：
抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多或者勻漿溫度過高。
5 、 外源 RNA 酶的污染：
試劑、器械等實驗用品應(yīng)該采用DEPC 水滅菌處理。
RNA降解是非常嚴(yán)重的問題，在RNA提取過程中，為防止降解我們需要遵守以下4點基本規(guī)則：
二、基本規(guī)則：
1. 把所有接觸RNA的塑料制品以及玻璃制品都高壓滅菌。
2. 用于RNA 緩沖液的所有水都要經(jīng)DEPC處理。加DEPC到終濃度0.1%，再室溫放放置過夜，或者滅菌15min 。DEPC 不能用于Tris 緩沖液，因為DEPC將會降解成乙醇和二氧化碳。
3. 避免堿性緩沖液，因為RNA中的羥基對堿非常敏感。
4. 將RNA 緩沖液與其他緩沖液分開放置，避免用錯或被RNases污染。
Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進(jìn)行提取組織或細(xì)胞中的RNA。
Trizol作用原理:
在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入lv仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。
水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。
接下來了解RNA提取中RNA降解原因：
一、RNA降解原因：
1 、 新鮮細(xì)胞：
裂解液的量不足，使得裂解不充分。
2 、 新鮮組織：
某些含有內(nèi)源性核酸酶的樣品，很難避免RNA酶的降解，建議采用的方法為在液氮條件下將組織研碎，并且，勻漿時采用更多的裂解液。
3 、冷凍樣品：
樣品取材后應(yīng)該迅速置于液氮中冷凍存放，然后轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放。如果未經(jīng)液氮速冷直接轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放，會造成RNA緩慢降解。樣品研磨后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
4 、內(nèi)源 RNA 酶的污染：
抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多或者勻漿溫度過高。
5 、 外源 RNA 酶的污染：
試劑、器械等實驗用品應(yīng)該采用DEPC 水滅菌處理。
RNA降解是非常嚴(yán)重的問題，在RNA提取過程中，為防止降解我們需要遵守以下4點基本規(guī)則：
二、基本規(guī)則：
1. 把所有接觸RNA的塑料制品以及玻璃制品都高壓滅菌。
2. 用于RNA 緩沖液的所有水都要經(jīng)DEPC處理。加DEPC到終濃度0.1%，再室溫放放置過夜，或者滅菌15min 。DEPC 不能用于Tris 緩沖液，因為DEPC將會降解成乙醇和二氧化碳。
3. 避免堿性緩沖液，因為RNA中的羥基對堿非常敏感。
4. 將RNA 緩沖液與其他緩沖液分開放置，避免用錯或被RNases污染。
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