PCR引物設(shè)計(jì)優(yōu)化需考慮方面
PCR引物設(shè)計(jì)，核心目的是為了追求擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。我們將從以下幾個(gè)方面考慮問題。
1．引物的長度
引物越長，特異性越好，但是更難與模板鏈結(jié)合，因此更難反應(yīng)，擴(kuò)增效率更低。此外，引物的長度還由DNA復(fù)制酶決定，并且與退火溫度有關(guān)
一般的，引物長度為18-30bp；
2．GC含量
Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。Tm值與GC值相互聯(lián)系，引物的熔化溫度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之間，當(dāng)Tm值為72℃時(shí)，復(fù)性條件最佳。，對應(yīng)的，目標(biāo) GC 含量在 40% 至 60% 之間。
對于上下游引物，兩種引物之間應(yīng)該CG含量與Tm值相差不大。若差別較大，可以添加額外的AT在DNA聚合酶不作用的引物5’端。
3．引物末端（3’）的設(shè)計(jì)
引物3'端不能選擇A，最好選擇T。引物3'端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇T。
引物3' 端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。
不能有GC長鏈（連續(xù)多于兩個(gè)）。GC長鏈有可能與模板鏈上的GC密集區(qū)錯配，引發(fā)錯誤的反應(yīng)。
堿基排列，應(yīng)該防止兩個(gè)引物3’間的配對，防止生成二聚體，同時(shí)應(yīng)該防止5’與3’配對，防止生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
4．引物∆G值
ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高，因?yàn)閺?’進(jìn)行的反應(yīng)更方便。3'端的ΔG值相對要低，但不可過高，引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
5．引物堿基序列
首先，兩個(gè)引物或者單個(gè)引物，盡量不出現(xiàn)互補(bǔ)片段。盡量不出現(xiàn)連續(xù)的堿基序列，防止錯誤結(jié)合。
此外，還需要使用BLAST軟件進(jìn)行檢測，防止引物與模板鏈的其他位置結(jié)合。
一般的，有許多相關(guān)的軟件或者網(wǎng)頁可以進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，比如NCBI中的Primer-Blast或者Oligo軟件。以Primer-Blast為例，里面可以自定義引物的起點(diǎn)終點(diǎn)，包含內(nèi)含子外顯子的引物設(shè)計(jì)，自動BLAST檢測，還可以輸入自己設(shè)計(jì)的引物去分析。
1．引物的長度
引物越長，特異性越好，但是更難與模板鏈結(jié)合，因此更難反應(yīng)，擴(kuò)增效率更低。此外，引物的長度還由DNA復(fù)制酶決定，并且與退火溫度有關(guān)
一般的，引物長度為18-30bp；
2．GC含量
Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。Tm值與GC值相互聯(lián)系，引物的熔化溫度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之間，當(dāng)Tm值為72℃時(shí)，復(fù)性條件最佳。，對應(yīng)的，目標(biāo) GC 含量在 40% 至 60% 之間。
對于上下游引物，兩種引物之間應(yīng)該CG含量與Tm值相差不大。若差別較大，可以添加額外的AT在DNA聚合酶不作用的引物5’端。
3．引物末端（3’）的設(shè)計(jì)
引物3'端不能選擇A，最好選擇T。引物3'端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇T。
引物3' 端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。
不能有GC長鏈（連續(xù)多于兩個(gè)）。GC長鏈有可能與模板鏈上的GC密集區(qū)錯配，引發(fā)錯誤的反應(yīng)。
堿基排列，應(yīng)該防止兩個(gè)引物3’間的配對，防止生成二聚體，同時(shí)應(yīng)該防止5’與3’配對，防止生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
4．引物∆G值
ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高，因?yàn)閺?’進(jìn)行的反應(yīng)更方便。3'端的ΔG值相對要低，但不可過高，引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
5．引物堿基序列
首先，兩個(gè)引物或者單個(gè)引物，盡量不出現(xiàn)互補(bǔ)片段。盡量不出現(xiàn)連續(xù)的堿基序列，防止錯誤結(jié)合。
此外，還需要使用BLAST軟件進(jìn)行檢測，防止引物與模板鏈的其他位置結(jié)合。
一般的，有許多相關(guān)的軟件或者網(wǎng)頁可以進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，比如NCBI中的Primer-Blast或者Oligo軟件。以Primer-Blast為例，里面可以自定義引物的起點(diǎn)終點(diǎn)，包含內(nèi)含子外顯子的引物設(shè)計(jì)，自動BLAST檢測，還可以輸入自己設(shè)計(jì)的引物去分析。
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