類器官固定包埋實驗具體步驟

1.類器官收集
收集生長至較大尺寸類器官：96孔板，生長密度較大時，使用移液槍取半孔以上，清洗1至3遍，洗去大部分基質(zhì)膠，離心沉淀，棄除大部分上清。

2.瓊脂糖固定槽制備（可一次制備一批，溫密閉保存）
1）稱量0.2至0.4g瓊脂糖，加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi)；
2）加入10mL左右PBS；
3）微波爐高火融化，每隔5s暫停打開，觀察，重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化完全；
4）取約200uL融化瓊脂糖，加入至600uL EP管內(nèi)；
5）在盛有瓊脂糖的小EP管內(nèi)插入一小PCR管，使瓊脂糖形成一圓尖底凹槽，室溫或者4℃冰箱靜置數(shù)分鐘，至瓊脂糖凝固，輕輕轉(zhuǎn)動小PCR管，取出PCR管，可看到瓊脂糖內(nèi)形成一個深圓尖底槽。

3.類器官固定
1）將類器官輕輕吸出轉(zhuǎn)移至一固定槽底部；
2）輕輕加入PBS至高于瓊脂糖槽的邊緣；
3）蓋上蓋子，水平離心機(jī)1000 rpm，離心5min；
4）輕輕吸出除底部類器官沉淀外的PBS上清；
5）加入融化的瓊脂糖液體200μL；
6）室溫靜置至瓊脂糖完全凝固；
7）剪去固定管的底部和蓋子，置于2 mL EP管內(nèi)，加入多聚甲醛至差不多裝滿整個EP管，置于4℃冰箱過夜。

4.類器官包埋
1）脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊，在梯度乙醇中脫水，70%、80%、90%、95%乙醇各1h，100%乙醇30min,待其凝固。
2）融蠟：提前4h左右打開烘箱，65℃溶蠟。
3）透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中），將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次
注：因二甲苯有毒性，需在通風(fēng)良好區(qū)域進(jìn)行操作，取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。
4）浸蠟：透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中，60℃浸蠟2h后，更換新的蠟缸再次浸蠟2h。
5）包埋：包埋在冰盒上進(jìn)行，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊完全凝固后，小心脫下模具。

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