多元 PCR引物設(shè)計技能詳解

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一個 PCR 反應(yīng)中使用一個模板和幾對引物同時擴增多個目的片段的 PCR 反應(yīng)。這項技術(shù)非常有用，他不僅可以提高 PCR 的產(chǎn)率還能提高 DNA 樣品的利用率。

另一種形式的 MPCR 是組合 PCR, 組合 PCR 是在同一 PCR 反應(yīng)中使用幾個不同的模板和幾對引物。多元 PCR 和組合 PCR 往往被當(dāng)作同義詞使用。

MPCR 要求所有的引物對在同一條件下擴增其各自的特異序列。大多數(shù)多元 PCR 反應(yīng) 局限于擴增 5~10 個目的片段，原因之一是反應(yīng)中，每另加入一對引物會導(dǎo)致一定程度的靈活性的丟失。引物數(shù)量的增加也使引物二聚體和非特異擴增出現(xiàn)的概率增加。因此，進行多元 PCR 要求周密計劃，且需多次嘗試，使反應(yīng)條件優(yōu)化。

理論上，一個多元反應(yīng)中，所有引物擴增其特異序列的效率應(yīng)該是一樣的，但通常是很難預(yù)測一對引物的效率。在相似條件下，退火溫度幾乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物設(shè)計和優(yōu)化的一般規(guī)律：

當(dāng)設(shè)計 MPCR 引物時，除了引物設(shè)計的一般規(guī)律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個多元反應(yīng)中使用的所有引物的 Tm 值應(yīng)該接近，要避免 3'-核苷酸互補，每一對引物應(yīng)獨立地優(yōu)化其反應(yīng)條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進行優(yōu)化。

1. 引物長度應(yīng)為 18~24 個堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。
2. 對于 MPCR，退火溫度和循環(huán)數(shù)非常關(guān)鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認(rèn)每一對 引物單獨擴增時的退火溫度，然后在多元 PCR 反應(yīng)時采用最低的退火溫度。同樣，要采用最少的擴增數(shù)。
3. 由于多個模板同時擴增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且完全合成所有 產(chǎn)物所需的時間增加。因此，優(yōu)化每個反應(yīng)的試劑濃度和延伸時間就顯得非常重要。相對于 單個目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時間較長。