逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)流程、注意事項(xiàng)和應(yīng)用

逆轉(zhuǎn)錄是指以 RNA 為模板，合成與其互補(bǔ)的 cDNA 的過程。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）和 cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，故逆轉(zhuǎn)錄稱為 RT-PCR 或反轉(zhuǎn)錄 PCR。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 實(shí)驗(yàn)原理為：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以 RNA 為模板，首先在利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再以 cDNA 鏈為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的出現(xiàn)使 RNA 檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。

逆轉(zhuǎn)錄 PCR 應(yīng)用：
逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的用途廣泛，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測(cè)細(xì)胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探針、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在臨床上 RT-PCR 可以用于遺傳病診斷、癌癥檢測(cè)、檢測(cè)病人標(biāo)本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究環(huán)境脅迫對(duì)植物基因表達(dá)的影響，以及在特定的環(huán)境或生長(zhǎng)階段中植物體不同部位基因表達(dá)的差異性。使用 RT-PCR 檢測(cè)分析 RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：
1、理論上可以檢測(cè)幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；
2、可以實(shí)現(xiàn)極為微量 RNA 樣品（ng 級(jí)別）的檢測(cè)；
3、樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測(cè)；

實(shí)驗(yàn)流程：
從細(xì)胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs 的反應(yīng)體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對(duì)→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應(yīng)流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。

RT-PCR“兩步法”與“一步法”：
RT-PCR 的實(shí)驗(yàn)操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。
一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構(gòu)建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應(yīng)在同一 Buffer 及酶中進(jìn)行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。
兩步法 RT-PCR 首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，即 RNA 反轉(zhuǎn)錄與 PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機(jī)會(huì)、減少了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、減少了 PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配率。RT-PCR 兩步法的優(yōu)勢(shì)在于存在中間產(chǎn)物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的 1/10 進(jìn)行反應(yīng)，有利于 PCR 條件的調(diào)整，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性強(qiáng)；兩步法可以在第二步 PCR 反應(yīng)體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實(shí)驗(yàn)預(yù)算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染問題。

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：
1、RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；
2、 RNA 提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； 
3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無 RNAase 環(huán)境，以避免模板 RNA 降解。