蛋白質(zhì)磷酸化研究的相關(guān)方法節(jié)選

      對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)科研來(lái)說(shuō)，抗酪氨酸磷酸化抗體的出現(xiàn)是一個(gè)意義重大的事件。在沒(méi)有抗酪氨酸磷酸化抗體之前，蛋白質(zhì)和酶的酪氨酸磷酸化只能通過(guò)非常危險(xiǎn)的并且很費(fèi)時(shí)的放射性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。而利用抗酪氨酸磷酸化抗體，則可以通過(guò)Western Blot或其它免疫學(xué)方法輕松地檢測(cè)到磷酸化信號(hào)。常規(guī)的檢測(cè)方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗體在Western Blot上檢測(cè)內(nèi)源或外源表達(dá)的磷酸化蛋白。如果目標(biāo)蛋白的含量較低，也可利用免疫沉淀的方法先富集發(fā)生磷酸化的酪氨酸蛋白，再檢測(cè)目標(biāo)蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗體也常用于檢測(cè)在不同處理的條件下，細(xì)胞內(nèi)總的酪氨酸磷酸化水平的變化情況，作為許多細(xì)胞生物現(xiàn)象的一個(gè)重要指標(biāo)。

        我們都知道如果需要檢測(cè)某一個(gè)目標(biāo)蛋白的某一特定位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，可以選用該蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點(diǎn)，或者這些蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過(guò)磷酸化抗體，就會(huì)知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難，而且浪費(fèi)大量寶貴時(shí)間�，F(xiàn)在國(guó)外的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，也可以達(dá)到同樣的檢測(cè)目的。以Yuan的文章為例，他們需要檢測(cè)BCR-ABL的磷酸化，但他們沒(méi)有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來(lái)免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過(guò)Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗體（pan-phosphotyrosine）來(lái)鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學(xué)家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗體來(lái)檢測(cè)DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通過(guò)區(qū)分這些蛋白的分子量大小，來(lái)確認(rèn)相應(yīng)的磷酸化條帶的蛋白身份。