AF6敲除上調(diào)膽汁酸分泌促進(jìn)CXCL14介導(dǎo)的HCC抗腫瘤免疫

主要技術(shù)
單細(xì)胞RNA測序（技術(shù)服務(wù)伯豪生物提供）

主要研究
1. AF6通過調(diào)控HNF4α抑制初級膽汁酸合成，敲除后抑制肝癌進(jìn)展
Afadin（AF6）是一種在上皮組織中普遍表達(dá)的支架極性蛋白，支持細(xì)胞粘附、遷移、分化和存活。基于之前的研究，作者猜測AF6基因可能是調(diào)控肝組織膽汁酸合成的關(guān)鍵因子。因此對肝細(xì)胞特異性敲除Af6（AF6⁻/⁻）肝癌小鼠進(jìn)行RNA測序分析及分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示AF6可與膽汁酸合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HNFα相互作用，通過核定位序列介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)位抑制HNF4α的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而下調(diào)CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1等初級膽汁酸合成限速酶的表達(dá)。AF6敲除后，這些酶的蛋白與mRNA水平顯著上調(diào)，肝臟內(nèi)�；悄懰幔═-CA）、β-鼠膽酸（β-MCA）等初級膽汁酸濃度大幅升高。表型分析顯示，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤數(shù)量及腫瘤直徑顯著降低，肝脾重量等腫瘤負(fù)荷指標(biāo)明顯改善，該表型在水動(dòng)力轉(zhuǎn)染癌基因的多個(gè)肝癌模型中均得到驗(yàn)證；而過表達(dá)AF6會(huì)加速腫瘤發(fā)展并降低肝臟膽汁酸水平，證實(shí)AF6通過調(diào)控初級膽汁酸合成介導(dǎo)肝癌進(jìn)展。

圖1 AF6與HNF4α相互作用介導(dǎo)的膽汁酸合成改變影響肝癌進(jìn)展

2. AF6敲除通過膽汁酸代謝重編程上調(diào)CXCL14 
作者重新分析AF6敲除肝癌小鼠的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)通路顯著激活，其中趨化因子編碼基因CXCL14的上調(diào)幅度最為顯著，qPCR與ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AF6⁻/⁻小鼠腫瘤組織中CXCL14 mRNA高表達(dá)，且血清中CXCL14蛋白濃度顯著升高，該結(jié)果在多種肝癌模型中均一致，而過表達(dá)AF6則會(huì)抑制CXCL14的表達(dá)，免疫熒光顯示CXCL14在AF6⁻/⁻小鼠腫瘤邊緣富集。為驗(yàn)證CXCL14的功能，作者通過腺相關(guān)病毒（AAV-TBG-Cxcl14）在AF6 flox/flox肝癌小鼠中肝特異性過表達(dá)CXCL14，結(jié)果顯示腫瘤負(fù)荷顯著降低，腫瘤數(shù)量與肝重比明顯下降；而敲除AF6⁻/⁻小鼠的CXCL14會(huì)逆轉(zhuǎn)AF6敲除的抑瘤效應(yīng)，加速肝癌進(jìn)展，表明CXCL14是受AF6負(fù)調(diào)控、介導(dǎo)肝癌抑制的關(guān)鍵抑瘤性趨化因子。此外，給予AF6flox/flox肝癌小鼠1%T-CA飲食可模擬AF6敲除的表型，顯著抑制腫瘤進(jìn)展并上調(diào)血清與腫瘤組織中的CXCL14，表明AF6調(diào)控的T-CA是CXCL14上調(diào)的重要上游信號。

圖2 CXCL14 在抑制肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用

3. 膽汁酸通過重塑腸道菌群使丁酸水平升高，丁酸經(jīng)腸肝軸介導(dǎo)CXCL14上調(diào)
體外實(shí)驗(yàn)中，用T-CA、β-MCA等關(guān)鍵初級膽汁酸處理肝癌細(xì)胞系及患者來源肝癌類器官，并未直接誘導(dǎo)CXCL14表達(dá)，提示膽汁酸并非通過直接作用調(diào)控CXCL14。宏基因組測序顯示，AF6⁻/⁻肝癌小鼠腸道菌群組成發(fā)生顯著改變，雙歧桿菌、糞桿菌、擬桿菌、乳桿菌等短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)生菌屬顯著富集，靶向代謝組學(xué)檢測到小鼠肝臟中乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸水平大幅升高。同時(shí)，AF6敲除后回腸與肝臟中ASBT、NTCP等膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了腸肝循環(huán)，過表達(dá)AF6則會(huì)降低丁酸水平并抑制轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，T-CA飲食可模擬AF6敲除的菌群與代謝物變化。體外功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丁酸可顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞系及人、鼠肝癌類器官中CXCL14的mRNA與蛋白分泌水平，而乙酸、丙酸無此效應(yīng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給野生型小鼠補(bǔ)充丁酸可使血清中的CXCL14升高，給肝癌小鼠補(bǔ)充丁酸則顯著抑制腫瘤進(jìn)展，同時(shí)上調(diào)血清與肝臟CXCL14水平，證實(shí)膽汁酸通過重塑腸道菌群提升丁酸水平，丁酸是經(jīng)腸肝軸介導(dǎo)CXCL14上調(diào)的關(guān)鍵中介。

圖3膽汁酸代謝改變腸道菌群組成，菌群來源的丁酸通過腸-肝軸促進(jìn) CXCL14 的表達(dá)

4. CXCL14通過招募并激活樹突狀細(xì)胞塑造抑瘤性腫瘤微環(huán)境
為明確CXCL14的抑瘤機(jī)制，作者對AF6敲除肝癌小鼠腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。結(jié)果顯示CXCL14主要由肝細(xì)胞表達(dá)，免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)肝細(xì)胞是CXCL14的分泌來源。細(xì)胞間通訊分析顯示CXCL14⁺細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞（DC）、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞存在強(qiáng)烈信號交互，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)AF6⁻/⁻小鼠腫瘤內(nèi)DC細(xì)胞比例顯著升高，而巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞無比例明顯變化。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組 Cxcl14 能有效誘導(dǎo)DC細(xì)胞的趨化作用，且經(jīng) Cxcl14 處理的DC細(xì)胞中MHC-II、CD80 和 CD86 的表達(dá)水平顯著升高。體內(nèi)耗竭實(shí)驗(yàn)中，用抗CD11c中和抗體耗竭AF6⁻/⁻小鼠的DC細(xì)胞后，肝臟丁酸與血清CXCL14水平未受影響，但AF6敲除的抑瘤效應(yīng)完全消失，腫瘤數(shù)量與肝脾重量比顯著回升，證實(shí)CXCL14招募并激活DC細(xì)胞，是塑造抑瘤性腫瘤微環(huán)境的核心環(huán)節(jié)。

圖4 CXCL14 通過募集樹突狀細(xì)胞并增強(qiáng)其抗原提呈能力抑制肝癌進(jìn)展

5. DC細(xì)胞介導(dǎo)CXCL14對CD8⁺T細(xì)胞的活化，AF6-BA-丁酸-CXCL14軸在人肝癌中具有臨床相關(guān)性
腫瘤組織單細(xì)胞RNA測序結(jié)果中的T細(xì)胞重聚類。分析顯示，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤內(nèi)效應(yīng)增殖型CD8⁺T細(xì)胞亞群比例顯著升高，該亞群為主要的細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞群體。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤浸潤C(jī)D8⁺T細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α、GZMB等細(xì)胞毒性因子分泌增加，PD-1等耗竭標(biāo)志物表達(dá)降低；體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，CXCL14處理的DC細(xì)胞可顯著促進(jìn)CD8⁺T細(xì)胞的增殖與細(xì)胞毒性因子分泌，而直接用CXCL14處理CD8⁺T細(xì)胞則無此效應(yīng)，膽汁酸與丁酸也無法直接調(diào)控CD8⁺T細(xì)胞功能。CD8⁺T細(xì)胞耗竭后，AF6敲除的抑瘤效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，證實(shí)CD8⁺T細(xì)胞是CXCL14-DC軸介導(dǎo)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞；過表達(dá)CXCL14可增加腫瘤內(nèi)DC細(xì)胞浸潤與CD8⁺T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，敲除CXCL14則會(huì)抑制CD8⁺T細(xì)胞功能。臨床樣本分析顯示，人肝癌組織中AF6表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且AF6高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，肝癌組織中丁酸水平低于正常肝組織并與AF6表達(dá)負(fù)相關(guān)，肝癌患者血清與腫瘤組織中CXCL14水平顯著降低，且AF6與CXCL14表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，高CXCL14表達(dá)及低AF6/CXCL14比值與患者良好預(yù)后相關(guān)，證實(shí)AF6-膽汁酸-丁酸-CXCL14軸在人肝癌中高度保守，具有重要的臨床預(yù)后與治療意義。

圖5 膽汁酸代謝改變通過樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中 CD8⁺T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性

參考文獻(xiàn)：
1. Xu K, Dong X, Qu H, et al (2026) AF6 knockout-induced upregulation of bile acid production promotes CXCL14-mediated antitumor immunity in HCC. J Hepatol S0168-8278(26)00016–4. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2025.12.029