NCB文獻(xiàn)解讀：H3K36me2在植入后胚胎DNA甲基化重建中的調(diào)控機(jī)制
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
近日，山東大學(xué)盧緒坤副研究員、清華大學(xué)頡偉教授和復(fù)旦大學(xué)張宇青年研究員團(tuán)隊(duì)合作，通過全基因組DNA甲基化測序（WGBS）、染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq）等分析系統(tǒng)揭示了組蛋白修飾H3K36me2在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)重編程規(guī)律及其對(duì)胚胎植入后譜系特異性de novo DNA甲基化中的關(guān)鍵調(diào)控作用。相關(guān)研究成果以“Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation”為題發(fā)表于《Nature Cell Biology 》期刊。
研究通過STAR ChIP-seq和WGBS等高通量測序技術(shù)，繪制了從卵母細(xì)胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組圖譜，并發(fā)現(xiàn)H3K36me2在合子基因組（ZGA）激活后分兩步重建（de novo）：首先在ZGA后定位于增強(qiáng)子區(qū)域，隨后在植入后擴(kuò)散至全基因組（除失活X染色體外）。有趣的是，這種重編程通過差異性調(diào)控DNMT3A和DNMT3B兩種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎譜系（高甲基化）和胚外譜系（部分甲基化）以及特定位點(diǎn)（生殖系基因啟動(dòng)子）DNA甲基化建立的精準(zhǔn)調(diào)控。本研究結(jié)果為理解哺乳動(dòng)物表觀遺傳重編程機(jī)制提供了重要理論依據(jù)。
英文標(biāo)題：Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation
中文標(biāo)題：H3K36me2重編程調(diào)控譜系特異性植入后的de novo DNA甲基化
發(fā)表時(shí)間：2025年11月11日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、WGBS、Smart-seq2
作者單位：山東大學(xué)、清華大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)
DOI:10.1038/s41556-025-01805-8
廣泛所知，哺乳動(dòng)物在受精后會(huì)經(jīng)歷全局DNA去甲基化，隨后在胚胎植入后重建，但其背后分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究探究了小鼠早期發(fā)育過程中H3K36me2重編程規(guī)律及其在植入后DNA甲基化重建中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞中，H3K36me2伴隨轉(zhuǎn)錄沉默主要在基因體區(qū)域積累，并部分維持至8細(xì)胞期；當(dāng)合子基因組激活后，H3K36me2在增強(qiáng)子區(qū)域重建，隨后在植入后擴(kuò)散至全基因組。此外，H3K36me2甲基轉(zhuǎn)移酶NSD1突變會(huì)損害植入后的全局DNA甲基化，尤其在胚外譜系以及易甲基化的啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)顯著。同時(shí)，DNA甲基化建立可通過DNMT3B上調(diào)且存在部分不依賴于H3K36me2，即沒有H3K36me2/3仍能發(fā)揮一定作用；與之相對(duì)的，DNMT3A通過PWWP結(jié)構(gòu)域并嚴(yán)格依賴H3K36me2/3才能進(jìn)行DNA甲基化。最后，研究還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化谷（DMVs）通過PRC1/H2AK119ub1介導(dǎo)的H3K36me2排斥機(jī)制避免了de novo DNA甲基化。因此，H3K36me2重編程調(diào)控了譜系特異性和位點(diǎn)特異性的植入后DNA甲基化建立。
易小結(jié)
本研究系統(tǒng)闡明了H3K36me2連接組蛋白修飾與DNA甲基化兩種關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記的分子機(jī)制，填補(bǔ)了植入后DNA甲基化重建調(diào)控機(jī)制的研究空白，對(duì)生殖醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及表觀遺傳疾病機(jī)理研究具有重要指導(dǎo)價(jià)值。
技術(shù)上，本研究充分發(fā)揮WGBS和ChIP-seq協(xié)同優(yōu)勢，構(gòu)建從染色質(zhì)狀態(tài)到DNA甲基化的完整調(diào)控機(jī)制，為解析動(dòng)態(tài)、微量樣本的表觀遺傳多組學(xué)整合策略在揭示復(fù)雜生物學(xué)過程中的重要作用，為未來探索其他發(fā)育或疾病模型中的表觀調(diào)控機(jī)制提供可借鑒的研究思路。
研究方法
（1）小鼠模型和樣本處理：
利用C57BL/6N和PWK/PhJ品系小鼠，收集從卵母細(xì)胞到胚胎第8.5天（E8.5）的各個(gè)發(fā)育階段樣本；分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)層（TE），并獲得植入后胚胎的胚胎外胚層（Epi）和胚外外胚層（ExE）譜系組織；構(gòu)建催化結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵位點(diǎn)缺失的Nsd1基因敲除（KO）小鼠。
（2）關(guān)鍵分子機(jī)制探索：
STAR ChIP-seq：對(duì)微量樣本（如卵母細(xì)胞、早期胚胎）進(jìn)行H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac、H3K27me3、H2AK119ub1等組蛋白修飾的全基因組定位分析。
全基因組甲基化測序（WGBS）：對(duì)胚胎和組織樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測，以評(píng)估不同發(fā)育階段和基因型下的甲基化動(dòng)態(tài)。
微量RNA-seq（Smart-seq2）：分析基因表達(dá)變化，并與表觀修飾數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。
（3）體外實(shí)驗(yàn)：
利用小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs），通過基因編輯（CRISPR-Cas9）構(gòu)建Nsd1敲除、PRC1核心組分（RING1A/B）缺失、以及DNMT3A/3B/TET等多基因敲除的細(xì)胞系。在體外模擬從“初始態(tài)”到“形成態(tài)”多能性轉(zhuǎn)變（2i到EpiLCs），研究DNA甲基化建立過程。
（4）藥理學(xué)干預(yù)：
使用轉(zhuǎn)錄抑制劑（α-amanitin, DRB）、細(xì)胞周期抑制劑（aphidicolin）、組蛋白乙酰化抑制劑（A-485）等處理胚胎，探究轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、組蛋白修飾對(duì)H3K36me2重編程的作用。
（5）分子生物學(xué)與生化實(shí)驗(yàn)：
免疫熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）、過表達(dá)DNMT3A/3B及其PWWP結(jié)構(gòu)域缺失突變體等，驗(yàn)證蛋白表達(dá)、定位及功能。
關(guān)鍵結(jié)果
（1）H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中動(dòng)態(tài)重編程及卵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄依賴性的H3K36me2/3動(dòng)態(tài)變化
研究團(tuán)隊(duì)首先通過免疫染色和STAR ChIP-seq技術(shù)（圖1a）繪制了從卵母細(xì)胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組分布圖譜。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H3K36me2動(dòng)態(tài)變化與H3K36me3（始終位于活躍基因體）存在顯著差異。在卵母細(xì)胞和植入前胚胎中，H3K36me2主要存在于基因體區(qū)域（圖1a藍(lán)色陰影），而在ZGA后， H3K36me2開始出現(xiàn)在增強(qiáng)子區(qū)域（圖1a紅色陰影及黑色箭頭），并在植入后擴(kuò)展至全基因組的基因間區(qū)域（圖1a綠色陰影），類似于小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）和體細(xì)胞中的模式。
在卵母細(xì)胞成熟過程中，H3K36me2和H3K36me3的分布與轉(zhuǎn)錄狀態(tài)密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)錄活躍的非包繞核仁(non-surrounded nucleolus,NSN)的成熟卵母細(xì)胞（full-grown oocyte,FGO)中，H3K36me3高度富集于活躍基因體，而H3K36me2水平較低（圖1b-c）。隨著卵母細(xì)胞成熟至轉(zhuǎn)錄沉默的包繞核仁（SN）FGO和MII期，基因體上的H3K36me2增加，H3K36me3減少（圖1b-c）。使用轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB處理NSN卵母細(xì)胞，可以介導(dǎo)活躍基因體上H3K36me2增加和H3K36me3減少（圖1d-e），證實(shí)了這種動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)錄依賴性。上述發(fā)現(xiàn)解釋了卵母細(xì)胞特異性DNA甲基化模式的建立機(jī)制，即H3K36me3主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的DNA甲基化，而H3K36me2可能在其他區(qū)域發(fā)揮作用。
（2）父源H3K36me2在早期合子中缺失，而母源H3K36me2在植入前發(fā)育中緩慢減少，ZGA后轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的H3K36me2重編程
通過等位基因特異性ChIP-seq分析，研究精確追蹤了雙親本H3K36me2命運(yùn)（圖2）。結(jié)果顯示，父源H3K36me2在受精后的早期合子中幾乎完全缺失（與免疫染色結(jié)果一致），隨后逐漸重建。而母源H3K36me2在1-8細(xì)胞期胚胎中被短暫繼承，其模式與MII期卵母細(xì)胞相似，之后逐漸減弱。因此，在囊胚ICM之前，全基因組范圍的H3K36me2呈現(xiàn)母源偏向。這種雙親本差異導(dǎo)致早期胚胎中H3K36me2存在顯著的母源偏倚，直至ICM階段才實(shí)現(xiàn)等位基因平衡。對(duì)于卵母細(xì)胞特異性基因，母源H3K36me2可維持至8細(xì)胞階段，而H3K36me3在MII期即已丟失，提示兩種修飾具有不同的染色質(zhì)繼承穩(wěn)定性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了早期胚胎中表觀遺傳信息的不對(duì)稱傳遞模式。
ZGA標(biāo)志著胚胎從母源調(diào)控向合子調(diào)控轉(zhuǎn)換，研究深入分析了此階段H3K36me2的重編程機(jī)制。在主要ZGA基因和持家基因（HK）中，ZGA后基因體區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2相對(duì)缺失，而側(cè)翼區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2重建（圖2b-c）。使用α-amanitin抑制轉(zhuǎn)錄可阻止2細(xì)胞期和8細(xì)胞期胚胎中ZGA基因和持家基因區(qū)域H3K36me2的這種重編程（圖2d-e）。表明ZGA后基因體上的H3K36me2重編程依賴于合子轉(zhuǎn)錄。
（3）H3K36me2在ZGA后于推定的增強(qiáng)子區(qū)域重建，H3K36me2在失活X染色體上缺失，并在X染色體再激活后于增強(qiáng)子區(qū)域重現(xiàn)
研究發(fā)現(xiàn)了H3K36me2重編程的關(guān)鍵特征。分析發(fā)現(xiàn)，ZGA后H3K36me2與增強(qiáng)子標(biāo)記H3K27ac的共定位顯著增強(qiáng)，相關(guān)性從1細(xì)胞期的R=0.28升至8細(xì)胞期的R=0.79（圖3a-b）。 遠(yuǎn)端H3K27ac峰在8細(xì)胞期被H3K36me2優(yōu)先標(biāo)記（圖3a底部）。使用A-485抑制P300/CBP介導(dǎo)的組蛋白乙�；�，特異性地?fù)p害了8細(xì)胞期胚胎中H3K27ac富集區(qū)域的H3K36me2重建（圖3c-d），表明組蛋白乙�；糠纸閷�(dǎo)H3K36me2向增強(qiáng)子招募。但H3K36me2在植入前并未擴(kuò)散至全基因組，其限制因子尚不完全清楚，可能存在其他調(diào)控機(jī)制。
在經(jīng)歷印記X染色體失活（XCI）的胚外譜系中，失活的父源X染色體（Xp）在植入前發(fā)育全階段始終維持極低的H3K36me2水平（圖3e）。在體外來源的胚外內(nèi)胚層（XEN）細(xì)胞中，沉默Xist導(dǎo)致失活X染色體部分再激活，伴隨H3K36me2在Xp上顯著增加，且與H3K27ac獲得和H2AK119ub1/H3K27me3減少密切相關(guān)（圖3f）。再激活后出現(xiàn)的H3K36me2峰靠近去抑制基因，提示其與增強(qiáng)子活性和基因激活相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)表明XCI狀態(tài)通過PRC1介導(dǎo)的H2AK119ub1和PRC2介導(dǎo)的H3K27me3排斥H3K36me2，維持Xi的表觀遺傳沉默。
（4）H3K36me2與胚外譜系中DNA甲基化建立相關(guān)性更強(qiáng)
研究利用已發(fā)表的野生型及Dnmt3a和Dnmt3b敲除胚胎數(shù)據(jù)，分析了H3K36me2/3與植入后DNA甲基化建立的相關(guān)性。在胚胎譜系(Epi)中中，野生型胚胎從ICM到E6.5的DNA甲基化增益與H3K36me3相關(guān)性較弱（R=0.08），與H3K36me2相關(guān)性中等（R=0.33）。Dnmt3b敲除后，DNMT3A依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3的相關(guān)性顯著增強(qiáng)（H3K36me2: R=0.50；H3K36me3: R=0.38），而Dnmt3a敲除后DNMT3B依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3相關(guān)性仍較低（圖4c-d）。相比之下，在胚外譜系（ExE）中，無論是野生型還是僅存在一種DNMT的情況下，DNA甲基化增益與H3K36me2/3相關(guān)性都更強(qiáng)（圖4c,f-g）。進(jìn)一步分析顯示，DNMT3A和DNMT3B主要甲基化H3K36me2/3標(biāo)記區(qū)域，而H3K36me2/3低的區(qū)域則更多地依賴于DNMT3B（圖4e）。這表明胚外譜系更依賴H3K36me2/3指導(dǎo)的DNA甲基化建立，可能與該譜系中Dnmt3a/3b表達(dá)水平較低有關(guān)。
圖4：與胚胎譜系相比，H3K36me2在胚外譜系中與DNA甲基化（DNAme）建立的相關(guān)性更強(qiáng)。
（5）H3K36me2調(diào)控體內(nèi)植入后DNA甲基化建立，H3K36me2促進(jìn)包括生殖系基因在內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化
通過建立Nsd1催化失活突變小鼠模型，研究直接驗(yàn)證了H3K36me2在體內(nèi)的功能。Nsd1敲除導(dǎo)致胚胎從E6.5起出現(xiàn)嚴(yán)重生長遲緩，E8.5前致死（圖5a-b）。H3K36me2在E6.5胚胎中整體丟失，主要影響非轉(zhuǎn)錄區(qū)域（圖5c）。WGBS分析顯示，突變體胚胎中H3K36me2富集區(qū)域的DNA甲基化在胚胎譜系中中度下降，但在胚外譜系中缺失顯著（圖5c-d）。而H3K36me3富集區(qū)域的DNA甲基化幾乎不受影響，提示DNMT3A/3B在H3K36me2缺失時(shí)被重定向至H3K36me3標(biāo)記區(qū)域。DNA甲基化缺失趨勢從E6.5到E8.5在胚胎譜系中逐漸減小，但在胚外譜系中加劇（圖5d），與兩種譜系中Dnmt3b表達(dá)差異相一致。上述研究結(jié)果表明在胚外譜系中，H3K36me2對(duì)植入后DNA甲基化建立至關(guān)重要。
研究者關(guān)注了一類對(duì)DNA甲基化敏感的生殖系基因（DMS germline genes）。WGBS分析顯示，在E6.5胚胎譜系中，Nsd1敲除導(dǎo)致這些基因的CpG島和非CpG島啟動(dòng)子甲基化降低，在胚外譜系中也觀察到類似的啟動(dòng)子低甲基化和部分基因去抑制（圖5e）。RNA-seq(Smart-seq2)分析發(fā)現(xiàn)Nsd1敲除的E6.5 Epi中有1158個(gè)基因上調(diào)、737個(gè)下調(diào)，上調(diào)基因顯著富集于減數(shù)分裂細(xì)胞周期和piRNA代謝通路，包括Piwil2、Ddx4、Asz1、Sohlh2、Sycp1等生殖系特異性基因；其中67個(gè)（48.9%）DMS生殖系基因上調(diào)表達(dá)，如Sohlh2和Tex19.1（圖5f-g）。這種啟動(dòng)子低甲基化和基因去抑制狀態(tài)持續(xù)至E8.5。值得注意的是，在野生型胚胎中，DMS生殖系基因啟動(dòng)子上的H3K36me2水平高于所有啟動(dòng)子的平均水平。表明H3K36me2促進(jìn)了植入后胚胎中啟動(dòng)子（包括生殖系基因啟動(dòng)子）甲基化維持生殖系基因的沉默狀態(tài)，防止其過早表達(dá)。
圖5：H3K36me2在體內(nèi)調(diào)控植入后DNA甲基化（DNAme）建立。
（6）H3K36me2調(diào)控體外“初始態(tài)”向“形成態(tài)”多能性轉(zhuǎn)變過程中的高效de novo DNA甲基化
研究利用2i mES細(xì)胞向EpiLCs分化的體外模型模擬“初始態(tài)”（naive）向“形成態(tài)”（formative）轉(zhuǎn)變（2i mESCs向EpiLCs分化）。結(jié)果顯示，Nsd1敲除在2i mES細(xì)胞中導(dǎo)致H3K36me2幾乎完全缺失，剩余信號(hào)僅存在于H3K36me3富集的活躍基因體（推測為SETD2活性所致）。
WGBS顯示，Nsd1敲除2i mES細(xì)胞中DNA甲基化水平極低，但主動(dòng)基因體出現(xiàn)DNA甲基化增加（可能由于DNMT3A重定向）；而在EpiLC分化過程中，Nsd1敲除細(xì)胞的DNA甲基化積累顯著延遲，尤其在H3K36me2富集區(qū)域（圖6b-d）。相比之下，從E3.5 ICM到E6.5 Epi的體內(nèi)發(fā)育中，Nsd1敲除的DNA甲基化缺失相對(duì)較輕（圖6e-f），可能與體內(nèi)Dnmt3a/3b表達(dá)水平更高有關(guān)（圖6g）。
結(jié)論和啟示
本研究系統(tǒng)揭示了H3K36me2在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中作為關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記信號(hào)及其動(dòng)態(tài)重編程規(guī)律，具體而言，H3K36me2通過差異性介導(dǎo)DNMT3A和DNMT3B實(shí)現(xiàn)對(duì)植入后譜系和位點(diǎn)特異性DNA甲基化重建的精準(zhǔn)調(diào)控。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對(duì)生命起源初期表觀基因組正確編程機(jī)制的理解，揭示了DNMT3A與DNMT3B在機(jī)制上的根本性差異，也為探索發(fā)育異常、疾病中表觀調(diào)控動(dòng)態(tài)變化提供了新的研究思路。研究所展示的多時(shí)間點(diǎn)、微量樣本多組學(xué)整合分析策略，為未來研究其他動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程中的表觀遺傳機(jī)制提供方法學(xué)參考。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的核心作用
ChIP-seq：克服早期胚胎樣本量極少的挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac等多種組蛋白修飾在多個(gè)精細(xì)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的全基因組動(dòng)態(tài)監(jiān)測，從而繪制出前所未有的H3K36me2重編程全景圖譜。
WGBS：提供DNA甲基化水平的單堿基分辨率檢測，將H3K36me2動(dòng)態(tài)變化與DNA甲基化建立直接關(guān)聯(lián)，并在Nsd1敲除、PRC1缺失等遺傳模型中定量評(píng)估甲基化缺失程度與區(qū)域特異性。
ChIP-seq和WGBS兩種技術(shù)的整合應(yīng)用，從“因”（組蛋白修飾）和“果”（DNA甲基化）上嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仳?yàn)證了H3K36me2的調(diào)控功能，并精細(xì)解析了其對(duì)不同譜系、不同位點(diǎn)的特異性影響，是本研究取得突破性發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)保障。
參考文獻(xiàn)：Lu X, Wang L, Liu B, Hu X, Wang Z, Liu L, Yu G, Dong L, Kong F, Fan Q, Zhang Y, Xie W. Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation. Nat Cell Biol. 2025 Nov 11. doi: 10.1038/s41556-025-01805-8.
近日，山東大學(xué)盧緒坤副研究員、清華大學(xué)頡偉教授和復(fù)旦大學(xué)張宇青年研究員團(tuán)隊(duì)合作，通過全基因組DNA甲基化測序（WGBS）、染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq）等分析系統(tǒng)揭示了組蛋白修飾H3K36me2在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)重編程規(guī)律及其對(duì)胚胎植入后譜系特異性de novo DNA甲基化中的關(guān)鍵調(diào)控作用。相關(guān)研究成果以“Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation”為題發(fā)表于《Nature Cell Biology 》期刊。
研究通過STAR ChIP-seq和WGBS等高通量測序技術(shù)，繪制了從卵母細(xì)胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組圖譜，并發(fā)現(xiàn)H3K36me2在合子基因組（ZGA）激活后分兩步重建（de novo）：首先在ZGA后定位于增強(qiáng)子區(qū)域，隨后在植入后擴(kuò)散至全基因組（除失活X染色體外）。有趣的是，這種重編程通過差異性調(diào)控DNMT3A和DNMT3B兩種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎譜系（高甲基化）和胚外譜系（部分甲基化）以及特定位點(diǎn)（生殖系基因啟動(dòng)子）DNA甲基化建立的精準(zhǔn)調(diào)控。本研究結(jié)果為理解哺乳動(dòng)物表觀遺傳重編程機(jī)制提供了重要理論依據(jù)。
英文標(biāo)題：Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation
中文標(biāo)題：H3K36me2重編程調(diào)控譜系特異性植入后的de novo DNA甲基化
發(fā)表時(shí)間：2025年11月11日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、WGBS、Smart-seq2
作者單位：山東大學(xué)、清華大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)
DOI:10.1038/s41556-025-01805-8
廣泛所知，哺乳動(dòng)物在受精后會(huì)經(jīng)歷全局DNA去甲基化，隨后在胚胎植入后重建，但其背后分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究探究了小鼠早期發(fā)育過程中H3K36me2重編程規(guī)律及其在植入后DNA甲基化重建中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞中，H3K36me2伴隨轉(zhuǎn)錄沉默主要在基因體區(qū)域積累，并部分維持至8細(xì)胞期；當(dāng)合子基因組激活后，H3K36me2在增強(qiáng)子區(qū)域重建，隨后在植入后擴(kuò)散至全基因組。此外，H3K36me2甲基轉(zhuǎn)移酶NSD1突變會(huì)損害植入后的全局DNA甲基化，尤其在胚外譜系以及易甲基化的啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)顯著。同時(shí)，DNA甲基化建立可通過DNMT3B上調(diào)且存在部分不依賴于H3K36me2，即沒有H3K36me2/3仍能發(fā)揮一定作用；與之相對(duì)的，DNMT3A通過PWWP結(jié)構(gòu)域并嚴(yán)格依賴H3K36me2/3才能進(jìn)行DNA甲基化。最后，研究還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化谷（DMVs）通過PRC1/H2AK119ub1介導(dǎo)的H3K36me2排斥機(jī)制避免了de novo DNA甲基化。因此，H3K36me2重編程調(diào)控了譜系特異性和位點(diǎn)特異性的植入后DNA甲基化建立。
易小結(jié)
本研究系統(tǒng)闡明了H3K36me2連接組蛋白修飾與DNA甲基化兩種關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記的分子機(jī)制，填補(bǔ)了植入后DNA甲基化重建調(diào)控機(jī)制的研究空白，對(duì)生殖醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及表觀遺傳疾病機(jī)理研究具有重要指導(dǎo)價(jià)值。
技術(shù)上，本研究充分發(fā)揮WGBS和ChIP-seq協(xié)同優(yōu)勢，構(gòu)建從染色質(zhì)狀態(tài)到DNA甲基化的完整調(diào)控機(jī)制，為解析動(dòng)態(tài)、微量樣本的表觀遺傳多組學(xué)整合策略在揭示復(fù)雜生物學(xué)過程中的重要作用，為未來探索其他發(fā)育或疾病模型中的表觀調(diào)控機(jī)制提供可借鑒的研究思路。
研究方法
（1）小鼠模型和樣本處理：
利用C57BL/6N和PWK/PhJ品系小鼠，收集從卵母細(xì)胞到胚胎第8.5天（E8.5）的各個(gè)發(fā)育階段樣本；分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)層（TE），并獲得植入后胚胎的胚胎外胚層（Epi）和胚外外胚層（ExE）譜系組織；構(gòu)建催化結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵位點(diǎn)缺失的Nsd1基因敲除（KO）小鼠。
（2）關(guān)鍵分子機(jī)制探索：
STAR ChIP-seq：對(duì)微量樣本（如卵母細(xì)胞、早期胚胎）進(jìn)行H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac、H3K27me3、H2AK119ub1等組蛋白修飾的全基因組定位分析。
全基因組甲基化測序（WGBS）：對(duì)胚胎和組織樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測，以評(píng)估不同發(fā)育階段和基因型下的甲基化動(dòng)態(tài)。
微量RNA-seq（Smart-seq2）：分析基因表達(dá)變化，并與表觀修飾數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。
（3）體外實(shí)驗(yàn)：
利用小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs），通過基因編輯（CRISPR-Cas9）構(gòu)建Nsd1敲除、PRC1核心組分（RING1A/B）缺失、以及DNMT3A/3B/TET等多基因敲除的細(xì)胞系。在體外模擬從“初始態(tài)”到“形成態(tài)”多能性轉(zhuǎn)變（2i到EpiLCs），研究DNA甲基化建立過程。
（4）藥理學(xué)干預(yù)：
使用轉(zhuǎn)錄抑制劑（α-amanitin, DRB）、細(xì)胞周期抑制劑（aphidicolin）、組蛋白乙酰化抑制劑（A-485）等處理胚胎，探究轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、組蛋白修飾對(duì)H3K36me2重編程的作用。
（5）分子生物學(xué)與生化實(shí)驗(yàn)：
免疫熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）、過表達(dá)DNMT3A/3B及其PWWP結(jié)構(gòu)域缺失突變體等，驗(yàn)證蛋白表達(dá)、定位及功能。
關(guān)鍵結(jié)果
（1）H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中動(dòng)態(tài)重編程及卵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄依賴性的H3K36me2/3動(dòng)態(tài)變化
研究團(tuán)隊(duì)首先通過免疫染色和STAR ChIP-seq技術(shù)（圖1a）繪制了從卵母細(xì)胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組分布圖譜。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H3K36me2動(dòng)態(tài)變化與H3K36me3（始終位于活躍基因體）存在顯著差異。在卵母細(xì)胞和植入前胚胎中，H3K36me2主要存在于基因體區(qū)域（圖1a藍(lán)色陰影），而在ZGA后， H3K36me2開始出現(xiàn)在增強(qiáng)子區(qū)域（圖1a紅色陰影及黑色箭頭），并在植入后擴(kuò)展至全基因組的基因間區(qū)域（圖1a綠色陰影），類似于小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）和體細(xì)胞中的模式。
在卵母細(xì)胞成熟過程中，H3K36me2和H3K36me3的分布與轉(zhuǎn)錄狀態(tài)密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)錄活躍的非包繞核仁(non-surrounded nucleolus,NSN)的成熟卵母細(xì)胞（full-grown oocyte,FGO)中，H3K36me3高度富集于活躍基因體，而H3K36me2水平較低（圖1b-c）。隨著卵母細(xì)胞成熟至轉(zhuǎn)錄沉默的包繞核仁（SN）FGO和MII期，基因體上的H3K36me2增加，H3K36me3減少（圖1b-c）。使用轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB處理NSN卵母細(xì)胞，可以介導(dǎo)活躍基因體上H3K36me2增加和H3K36me3減少（圖1d-e），證實(shí)了這種動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)錄依賴性。上述發(fā)現(xiàn)解釋了卵母細(xì)胞特異性DNA甲基化模式的建立機(jī)制，即H3K36me3主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的DNA甲基化，而H3K36me2可能在其他區(qū)域發(fā)揮作用。
圖1：小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中H3K36me2的定位圖譜
（2）父源H3K36me2在早期合子中缺失，而母源H3K36me2在植入前發(fā)育中緩慢減少，ZGA后轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的H3K36me2重編程
通過等位基因特異性ChIP-seq分析，研究精確追蹤了雙親本H3K36me2命運(yùn)（圖2）。結(jié)果顯示，父源H3K36me2在受精后的早期合子中幾乎完全缺失（與免疫染色結(jié)果一致），隨后逐漸重建。而母源H3K36me2在1-8細(xì)胞期胚胎中被短暫繼承，其模式與MII期卵母細(xì)胞相似，之后逐漸減弱。因此，在囊胚ICM之前，全基因組范圍的H3K36me2呈現(xiàn)母源偏向。這種雙親本差異導(dǎo)致早期胚胎中H3K36me2存在顯著的母源偏倚，直至ICM階段才實(shí)現(xiàn)等位基因平衡。對(duì)于卵母細(xì)胞特異性基因，母源H3K36me2可維持至8細(xì)胞階段，而H3K36me3在MII期即已丟失，提示兩種修飾具有不同的染色質(zhì)繼承穩(wěn)定性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了早期胚胎中表觀遺傳信息的不對(duì)稱傳遞模式。
ZGA標(biāo)志著胚胎從母源調(diào)控向合子調(diào)控轉(zhuǎn)換，研究深入分析了此階段H3K36me2的重編程機(jī)制。在主要ZGA基因和持家基因（HK）中，ZGA后基因體區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2相對(duì)缺失，而側(cè)翼區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2重建（圖2b-c）。使用α-amanitin抑制轉(zhuǎn)錄可阻止2細(xì)胞期和8細(xì)胞期胚胎中ZGA基因和持家基因區(qū)域H3K36me2的這種重編程（圖2d-e）。表明ZGA后基因體上的H3K36me2重編程依賴于合子轉(zhuǎn)錄。
圖2：H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中發(fā)生動(dòng)態(tài)重編程。
（3）H3K36me2在ZGA后于推定的增強(qiáng)子區(qū)域重建，H3K36me2在失活X染色體上缺失，并在X染色體再激活后于增強(qiáng)子區(qū)域重現(xiàn)
研究發(fā)現(xiàn)了H3K36me2重編程的關(guān)鍵特征。分析發(fā)現(xiàn)，ZGA后H3K36me2與增強(qiáng)子標(biāo)記H3K27ac的共定位顯著增強(qiáng)，相關(guān)性從1細(xì)胞期的R=0.28升至8細(xì)胞期的R=0.79（圖3a-b）。 遠(yuǎn)端H3K27ac峰在8細(xì)胞期被H3K36me2優(yōu)先標(biāo)記（圖3a底部）。使用A-485抑制P300/CBP介導(dǎo)的組蛋白乙�；�，特異性地?fù)p害了8細(xì)胞期胚胎中H3K27ac富集區(qū)域的H3K36me2重建（圖3c-d），表明組蛋白乙�；糠纸閷�(dǎo)H3K36me2向增強(qiáng)子招募。但H3K36me2在植入前并未擴(kuò)散至全基因組，其限制因子尚不完全清楚，可能存在其他調(diào)控機(jī)制。
在經(jīng)歷印記X染色體失活（XCI）的胚外譜系中，失活的父源X染色體（Xp）在植入前發(fā)育全階段始終維持極低的H3K36me2水平（圖3e）。在體外來源的胚外內(nèi)胚層（XEN）細(xì)胞中，沉默Xist導(dǎo)致失活X染色體部分再激活，伴隨H3K36me2在Xp上顯著增加，且與H3K27ac獲得和H2AK119ub1/H3K27me3減少密切相關(guān)（圖3f）。再激活后出現(xiàn)的H3K36me2峰靠近去抑制基因，提示其與增強(qiáng)子活性和基因激活相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)表明XCI狀態(tài)通過PRC1介導(dǎo)的H2AK119ub1和PRC2介導(dǎo)的H3K27me3排斥H3K36me2，維持Xi的表觀遺傳沉默。
圖3：H3K36me2在增強(qiáng)子區(qū)域重建可能由組蛋白乙�；閷�(dǎo)。
（4）H3K36me2與胚外譜系中DNA甲基化建立相關(guān)性更強(qiáng)
研究利用已發(fā)表的野生型及Dnmt3a和Dnmt3b敲除胚胎數(shù)據(jù)，分析了H3K36me2/3與植入后DNA甲基化建立的相關(guān)性。在胚胎譜系(Epi)中中，野生型胚胎從ICM到E6.5的DNA甲基化增益與H3K36me3相關(guān)性較弱（R=0.08），與H3K36me2相關(guān)性中等（R=0.33）。Dnmt3b敲除后，DNMT3A依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3的相關(guān)性顯著增強(qiáng)（H3K36me2: R=0.50；H3K36me3: R=0.38），而Dnmt3a敲除后DNMT3B依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3相關(guān)性仍較低（圖4c-d）。相比之下，在胚外譜系（ExE）中，無論是野生型還是僅存在一種DNMT的情況下，DNA甲基化增益與H3K36me2/3相關(guān)性都更強(qiáng)（圖4c,f-g）。進(jìn)一步分析顯示，DNMT3A和DNMT3B主要甲基化H3K36me2/3標(biāo)記區(qū)域，而H3K36me2/3低的區(qū)域則更多地依賴于DNMT3B（圖4e）。這表明胚外譜系更依賴H3K36me2/3指導(dǎo)的DNA甲基化建立，可能與該譜系中Dnmt3a/3b表達(dá)水平較低有關(guān)。
（5）H3K36me2調(diào)控體內(nèi)植入后DNA甲基化建立，H3K36me2促進(jìn)包括生殖系基因在內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化
通過建立Nsd1催化失活突變小鼠模型，研究直接驗(yàn)證了H3K36me2在體內(nèi)的功能。Nsd1敲除導(dǎo)致胚胎從E6.5起出現(xiàn)嚴(yán)重生長遲緩，E8.5前致死（圖5a-b）。H3K36me2在E6.5胚胎中整體丟失，主要影響非轉(zhuǎn)錄區(qū)域（圖5c）。WGBS分析顯示，突變體胚胎中H3K36me2富集區(qū)域的DNA甲基化在胚胎譜系中中度下降，但在胚外譜系中缺失顯著（圖5c-d）。而H3K36me3富集區(qū)域的DNA甲基化幾乎不受影響，提示DNMT3A/3B在H3K36me2缺失時(shí)被重定向至H3K36me3標(biāo)記區(qū)域。DNA甲基化缺失趨勢從E6.5到E8.5在胚胎譜系中逐漸減小，但在胚外譜系中加劇（圖5d），與兩種譜系中Dnmt3b表達(dá)差異相一致。上述研究結(jié)果表明在胚外譜系中，H3K36me2對(duì)植入后DNA甲基化建立至關(guān)重要。
研究者關(guān)注了一類對(duì)DNA甲基化敏感的生殖系基因（DMS germline genes）。WGBS分析顯示，在E6.5胚胎譜系中，Nsd1敲除導(dǎo)致這些基因的CpG島和非CpG島啟動(dòng)子甲基化降低，在胚外譜系中也觀察到類似的啟動(dòng)子低甲基化和部分基因去抑制（圖5e）。RNA-seq(Smart-seq2)分析發(fā)現(xiàn)Nsd1敲除的E6.5 Epi中有1158個(gè)基因上調(diào)、737個(gè)下調(diào)，上調(diào)基因顯著富集于減數(shù)分裂細(xì)胞周期和piRNA代謝通路，包括Piwil2、Ddx4、Asz1、Sohlh2、Sycp1等生殖系特異性基因；其中67個(gè)（48.9%）DMS生殖系基因上調(diào)表達(dá)，如Sohlh2和Tex19.1（圖5f-g）。這種啟動(dòng)子低甲基化和基因去抑制狀態(tài)持續(xù)至E8.5。值得注意的是，在野生型胚胎中，DMS生殖系基因啟動(dòng)子上的H3K36me2水平高于所有啟動(dòng)子的平均水平。表明H3K36me2促進(jìn)了植入后胚胎中啟動(dòng)子（包括生殖系基因啟動(dòng)子）甲基化維持生殖系基因的沉默狀態(tài)，防止其過早表達(dá)。
（6）H3K36me2調(diào)控體外“初始態(tài)”向“形成態(tài)”多能性轉(zhuǎn)變過程中的高效de novo DNA甲基化
研究利用2i mES細(xì)胞向EpiLCs分化的體外模型模擬“初始態(tài)”（naive）向“形成態(tài)”（formative）轉(zhuǎn)變（2i mESCs向EpiLCs分化）。結(jié)果顯示，Nsd1敲除在2i mES細(xì)胞中導(dǎo)致H3K36me2幾乎完全缺失，剩余信號(hào)僅存在于H3K36me3富集的活躍基因體（推測為SETD2活性所致）。
WGBS顯示，Nsd1敲除2i mES細(xì)胞中DNA甲基化水平極低，但主動(dòng)基因體出現(xiàn)DNA甲基化增加（可能由于DNMT3A重定向）；而在EpiLC分化過程中，Nsd1敲除細(xì)胞的DNA甲基化積累顯著延遲，尤其在H3K36me2富集區(qū)域（圖6b-d）。相比之下，從E3.5 ICM到E6.5 Epi的體內(nèi)發(fā)育中，Nsd1敲除的DNA甲基化缺失相對(duì)較輕（圖6e-f），可能與體內(nèi)Dnmt3a/3b表達(dá)水平更高有關(guān)（圖6g）。
圖6：H3K36me2在體外調(diào)控de novo DNA甲基化。
結(jié)論和啟示
本研究系統(tǒng)揭示了H3K36me2在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中作為關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記信號(hào)及其動(dòng)態(tài)重編程規(guī)律，具體而言，H3K36me2通過差異性介導(dǎo)DNMT3A和DNMT3B實(shí)現(xiàn)對(duì)植入后譜系和位點(diǎn)特異性DNA甲基化重建的精準(zhǔn)調(diào)控。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對(duì)生命起源初期表觀基因組正確編程機(jī)制的理解，揭示了DNMT3A與DNMT3B在機(jī)制上的根本性差異，也為探索發(fā)育異常、疾病中表觀調(diào)控動(dòng)態(tài)變化提供了新的研究思路。研究所展示的多時(shí)間點(diǎn)、微量樣本多組學(xué)整合分析策略，為未來研究其他動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程中的表觀遺傳機(jī)制提供方法學(xué)參考。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的核心作用
ChIP-seq：克服早期胚胎樣本量極少的挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac等多種組蛋白修飾在多個(gè)精細(xì)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的全基因組動(dòng)態(tài)監(jiān)測，從而繪制出前所未有的H3K36me2重編程全景圖譜。
WGBS：提供DNA甲基化水平的單堿基分辨率檢測，將H3K36me2動(dòng)態(tài)變化與DNA甲基化建立直接關(guān)聯(lián)，并在Nsd1敲除、PRC1缺失等遺傳模型中定量評(píng)估甲基化缺失程度與區(qū)域特異性。
ChIP-seq和WGBS兩種技術(shù)的整合應(yīng)用，從“因”（組蛋白修飾）和“果”（DNA甲基化）上嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仳?yàn)證了H3K36me2的調(diào)控功能，并精細(xì)解析了其對(duì)不同譜系、不同位點(diǎn)的特異性影響，是本研究取得突破性發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)保障。
參考文獻(xiàn)：Lu X, Wang L, Liu B, Hu X, Wang Z, Liu L, Yu G, Dong L, Kong F, Fan Q, Zhang Y, Xie W. Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation. Nat Cell Biol. 2025 Nov 11. doi: 10.1038/s41556-025-01805-8.
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