包涵體純化的步驟和技巧介紹

包涵體（Inclusion Bodies, IBs）是外源基因在原核生物（如大腸桿菌）中高效表達(dá)時(shí)，形成的由錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)聚集而成的、具有較高密度的沉淀，缺少生物活性。

包涵體的核心特征：
- 形態(tài)：顯微鏡下呈圓形或不規(guī)則顆粒，直徑0.2-1.5μm
- 成分：目標(biāo)蛋白占比60%-90%，混有少量宿主蛋白、核酸、脂類
- 性質(zhì)：水溶性差、密度大、抗蛋白酶降解、活性低

作為純化新手遇到包涵體常常是令人頭疼的問題，那么為什么會(huì)形成包涵體呢？
包涵體的形成主要是外源蛋白在原核系統(tǒng)中“過度表達(dá)”與“折疊滯后”的矛盾導(dǎo)致聚集：
1、表達(dá)速度過快：核糖體合成蛋白的速度遠(yuǎn)超分子伴侶輔助折疊的速度；
2、環(huán)境不匹配：原核生物缺乏真核蛋白折疊所需的修飾系統(tǒng)（如糖基化）及氧化還原環(huán)境；
3、序列特性：目標(biāo)蛋白本身含較多疏水氨基酸，易發(fā)生分子間疏水相互作用；
4、培養(yǎng)條件：高溫、高誘導(dǎo)劑濃度、營養(yǎng)缺乏等脅迫因素加劇聚集；

包涵體的形成并非全然是弊端，一方面它降低了外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，避免了蛋白酶對(duì)其的快速降解，有利于積累大量目標(biāo)產(chǎn)物；另一方面也為后續(xù)純化提供了便利，通過離心即可將包涵體與可溶性雜質(zhì)有效分離。只要經(jīng)過合理的變復(fù)性處理，部分蛋白仍能恢復(fù)活性。

如果您的蛋白形成了包涵體，那可以從兩個(gè)方面來考慮：1、通過優(yōu)化前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)的條件，減少包涵體的形成。2、通過有效的變性和復(fù)性的過程，使包涵體變?yōu)榛钚钥扇軤顟B(tài)進(jìn)行純化。

一、前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)條件優(yōu)化
生長速率的降低通常會(huì)促進(jìn)更多的可溶性表達(dá)，從而降低形成包涵體的傾向。對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行一些簡單的修改，降低生長速度或表達(dá)速度，優(yōu)化可溶性表達(dá)。缺點(diǎn)是重組蛋白的總產(chǎn)量也可能因此減少。

優(yōu)化方式可以從以下3點(diǎn)進(jìn)行考慮：
（1）通過將生長溫度降低到20°C到30°C之間，可以降低生長速率。對(duì)于在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下表達(dá)的蛋白質(zhì)，也可以通過改變誘導(dǎo)條件來降低表達(dá)率。在較低的細(xì)胞密度下誘導(dǎo)(A600 = 0.5)，減少誘導(dǎo)時(shí)間，使用較低濃度的誘導(dǎo)劑（例如，0.1 mM IPTG）誘導(dǎo)等。
（2）使用促溶標(biāo)簽，例如GST和麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽，可以提高目標(biāo)蛋白的溶解度。
（3）與伴侶蛋白共表達(dá)，協(xié)助目標(biāo)蛋白正確折疊分子伴侶的主要特性是它們能夠結(jié)合未折疊或部分折疊的多肽，從而有效地抑制聚集。例如GroEL/ES和DnaK和蛋白二硫異構(gòu)酶（PDI）共表達(dá)。

二、包涵體純化
包涵體純化主要包括以下步驟：質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)，細(xì)胞收集和破碎，包涵體分離，蛋白重溶，蛋白復(fù)性，蛋白純化。

1、包涵體分離和清洗
通過離心分離包涵體是一個(gè)高效的純化步驟，因?yàn)槟繕?biāo)蛋白通常是包涵體的主要成分。DNA、細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片與包涵體大小相同，在離心過程中可能與包涵體共沉。通常采用高壓均質(zhì)或超聲的方法破碎細(xì)胞。建議使用高壓均質(zhì)（例如，2萬psi進(jìn)行3輪）來減小細(xì)胞碎片的大小，以便在離心過程中更容易與包涵體分離。

細(xì)胞破裂后，添加DNase（10 μg/mL DNase I, 3 mM MgCl2, 30 min, 25°C）可以減少宿主DNA的量，添加去垢劑（例如，2% Triton X-100）可以減少脂質(zhì)和膜蛋白。高鹽濃度（如0.5 M NaCl）的存在有助于溶解雜蛋白。室溫孵育30分鐘后，可通過離心（25,000g， 30 min，4°C）收獲包涵體沉淀。

離心之后需要對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，以進(jìn)一步去除雜質(zhì)。洗滌緩沖液可以使用含有1% Triton X-100和20 mM EDTA的PBS， pH 7.4，在10 000至30 000 × g下離心10至30分鐘。去除上清，用相同的緩沖液懸浮和洗滌兩次，并在10000-30000 × g離心10 ~ 30min。收集含有包涵體的沉淀。

在一些已發(fā)表的方案中，在洗滌緩沖液中加入低濃度的變性劑（例如1-2 M尿素）或更高濃度的NaCl可以提高洗滌效率。

2、包涵體的重溶
包涵體重溶一般使用尿素和鹽酸胍，其他的選擇包括使用SDS (10%)， n -月桂酰肌氨酸，或其他洗滌劑和極端pH值。建議使用6-8M尿素和鹽酸胍作為初始嘗試，重溶的條件見下圖：

3、包涵體的復(fù)性
在溶解之后，蛋白質(zhì)必須適當(dāng)?shù)刂匦抡郫B以恢復(fù)功能。這是通過去除變性劑來完成的，以允許蛋白質(zhì)折疊并形成正確的分子內(nèi)結(jié)合。成功復(fù)性的秘訣在于促進(jìn)蛋白正確折疊并抑制蛋白聚集。

因此，必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定特定蛋白質(zhì)的合適復(fù)性條件。通常需要對(duì)一些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化：

（1）溫度
溫度是影響復(fù)性的一個(gè)重要參數(shù)。在大多數(shù)情況下，在較低的溫度下可以得到較高的復(fù)性產(chǎn)率和較少的聚集。低溫降低了折疊速度和疏水相互作用，而高溫時(shí)蛋白容易聚集。

到目前為止，還沒有任何一個(gè)普遍的最佳溫度用于不同蛋白的復(fù)性。大部分蛋白在接近室溫的情況下進(jìn)行復(fù)性過程。

（2）溶液PH
溶液的pH值也是復(fù)性的一個(gè)重要的因素。所有蛋白質(zhì)都有一個(gè)特征的pH范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)它們可以有效折疊并達(dá)到活性狀態(tài)。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH值5-9的范圍內(nèi)進(jìn)行復(fù)性，并且在pH值8-8.5時(shí)達(dá)到最佳復(fù)性條件�？梢試L試使用高于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)至少一個(gè)pH單位的pH值。

對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，堿性pH值對(duì)于二硫鍵的形成和重組是必要的。

（3）緩沖液添加劑
緩沖液添加劑被認(rèn)為是通過抑制聚集（尿素或鹽酸胍）或增強(qiáng)折疊（精氨酸、甘油、鹽）來幫助蛋白正確復(fù)性。

精氨酸會(huì)破壞非天然構(gòu)象的穩(wěn)定性。甘油和糖（蔗糖、甘露醇、山梨醇和海藻糖）：甘油在許多情況下是一種很好的再折疊添加劑，通常在5-30%的范圍內(nèi)使用。

（4）蛋白含有較多的二硫鍵
如果蛋白有二硫鍵，在重溶過程中需要添加還原劑（例如，1至10mM DTT)。在復(fù)性時(shí)，用二硫交換試劑去取代還原劑。加入二硫交換試劑（一組氧化-還原對(duì)，例如，氧化+還原谷胱甘肽（GSSG+GSH）或半胱胺+胱胺）以提供合適的氧化還原電位。

常用的復(fù)性方法有常規(guī)的稀釋和透析的方法，或者使用層析柱例如凝膠過濾層析，親和層析，離子交換層析等進(jìn)行柱上復(fù)性。不同的復(fù)性方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下圖：

（1）稀釋和透析
最常用的方法是在大體積的復(fù)性緩沖液中稀釋變性蛋白（通常為100倍）。在稀釋過程中必須充分的攪拌，以防止分子間相互作用和聚集�？梢詫⒌鞍诐舛日{(diào)整為1mg/ml，快速的稀釋或者緩慢將包涵體添加到復(fù)性緩沖液中。

透析的方法是指使用限定截留分子量的膜進(jìn)行透析。由于膜的截留分子量遠(yuǎn)低于目標(biāo)蛋白，因此目標(biāo)蛋白被膜保留，而緩沖液交換促進(jìn)蛋白復(fù)性。

（2）使用凝膠過濾層析進(jìn)行柱上復(fù)性
分子篩可以有效限制蛋白聚集，凝膠過濾層析對(duì)過程中可能連續(xù)形成的聚集體的不斷去除是高再復(fù)性收率的關(guān)鍵。

使用重溶緩沖液到復(fù)性緩沖液的遞減梯度平衡色譜柱。然后用復(fù)性緩沖液來洗脫蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)移到無變性的環(huán)境中。

（3）使用親和層析進(jìn)行柱上復(fù)性
親和層析柱上復(fù)性可以防止在隨后的變性劑去除過程中聚集。親和層析的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，只要不超過介質(zhì)的結(jié)合能力，就沒有樣品體積的限制。

具有較大親和標(biāo)簽例如GST，MBP標(biāo)簽通常不適合柱上復(fù)性。緩沖液中的變性劑會(huì)破壞標(biāo)簽和填料的結(jié)合。His和Strep標(biāo)簽可以在變性的條件下純化。使用不含有變性劑的復(fù)性緩沖液（例如：20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5 mM imidozole,1 mM 2-mercaptoethanol,pH 8.0

）平衡層析柱，進(jìn)行上樣，然后用平衡緩沖液復(fù)性，然后用高濃度咪唑進(jìn)行洗脫（例如：20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,0.5M imidozole,1 mM 2-mercaptoethanol,pH 8.0）。

（4）使用離子交換層析進(jìn)行柱上復(fù)性
變性蛋白溶液中含有高濃度變性劑或者鹽離子不適合使用離子交換�？梢允褂藐庪x子或者陽離子進(jìn)行柱上復(fù)性。

如果使用常規(guī)的稀釋或者透析法進(jìn)行蛋白復(fù)性，可以繼續(xù)使用以下產(chǎn)品對(duì)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化。

貨號(hào)	品名	規(guī)格	用途
17524701	HisTrap HP	5 × 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17531901	HisTrap FF	5 × 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17526801	Ni Sepharose HP	25 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17531806	Ni Sepharose 6 FF	5 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17528101	GSTrap HP	5 × 1 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17513001	GSTrap FF	5 × 1 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17075601	Glutathione Sepharose 4B	10 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（填料）
29401317	StrepTrap XT	1 × 1 ml	Strep標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
29401324	StrepTactin Sepharose XT	10ml	Strep標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
28918779	MBPTrap HP	1 × 5 ml	MBP標(biāo)簽蛋白純化(預(yù)裝柱)
28935597	Dextrin Sepharose HP	25ml	MBP標(biāo)簽蛋白純化(填料)
29148721	Superdex 75 Increase 10/300 GL	10 x 300 mm	凝膠過濾 3-70 KDa
28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL	10 x 300 mm	凝膠過濾 10 -600 KDa
29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL	10 x 300 mm	凝膠過濾 5-5000KDa
28934388	HiTrap Capto Selection Kit	5*1ml	離子交換試劑盒
17600233	HiTrap IEX Selection Kit	7*1ml	離子交換試劑盒
29275878	Capto HiRes Q	5 x 50 mm	陰離子交換柱
29051325	HiTrap Q HP	1 × 1 ml	陰離子交換柱
29051324	HiTrap SP HP	1 × 1 ml	陽離子交換柱
17505501	HiTrap DEAE FF	5 × 1 ml	弱陰離子交換柱
17051010	Q Sepharose FF	25 ml	陰離子填料
17072910	SP Sepharose FF	25 ml	陰離子填料
17070910	DEAE Sepharose FF	25 ml	陰離子填料
17531610	Capto Q	25ml	陰離子填料
17544110	Capto S	25ml	陽離子填料