MeRIP-seq揭示m6A甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控炎癥性肺病機(jī)制

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2026年1月22日，廣東醫(yī)科大學(xué)羅舒華博士和張茜茜碩士為共同第一作者、唐靖教授等為通訊作者，在TOP期刊《Journal of Advanced Research》發(fā)表題為“METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury”的研究論文，揭示了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在急性肺損傷（ALI）中調(diào)控中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）形成的新機(jī)制。研究通過(guò)MeRIP-seq等分析發(fā)現(xiàn)在肺部炎癥中，METTL3通過(guò)介導(dǎo)SYK mRNA的m6A修飾，增強(qiáng)其穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)，從而激活下游SYK/ERK/MEK信號(hào)軸，驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞的NETosis（胞外誘捕網(wǎng)形成過(guò)程）。遺傳學(xué)（條件性敲除小鼠）和藥理學(xué)（抑制劑STM2457和R406）干預(yù)均證實(shí)，靶向METTL3或SYK可有效抑制NETs形成、減輕肺部炎癥和血管損傷。該研究首次建立METTL3-m6A-SYK表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸與NETs驅(qū)動(dòng)的ALI之間的因果關(guān)聯(lián)，為治療炎癥性肺病提供了新的潛在靶點(diǎn)。
 
英文標(biāo)題：METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury
中文標(biāo)題：METTL3通過(guò)SYK/ERK/MEK信號(hào)通路促進(jìn)急性肺損傷中的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成
發(fā)表時(shí)間：2026年1月22日
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq
作者單位：廣東醫(yī)科大學(xué)、中山大學(xué)
DOI:10.1016/j.jare.2026.01.044
 
本研究旨在探討METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對(duì)NETs形成的作用及其在ALI肺損傷中的潛在機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)條件性敲除髓系或中性粒細(xì)胞譜系中的METTL3，探究其在ALI中的作用。采用組織學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析、基因干擾、過(guò)表達(dá)、MeRIP-seq和m6A-RIP-qPCR等方法，在體內(nèi)外闡明METTL3通過(guò)SYK/ERK/MEK信號(hào)軸促進(jìn)NETosis的具體機(jī)制。

研究結(jié)果顯示在髓系或中性粒細(xì)胞譜系中條件性敲除METTL3，可顯著降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI后肺組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性、瓜氨酸化組蛋白H3水平和細(xì)胞外DNA沉積。METTL3敲除可減輕肺部炎癥并減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，METTL3敲除的中性粒細(xì)胞在佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）刺激下表現(xiàn)出NETs形成減少，同時(shí)SYK磷酸化及其下游ERK/MEK活性降低。此外，機(jī)制研究表明，METTL3促進(jìn)SYK mRNA的m6A甲基化，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄。METTL3或SYK的藥理學(xué)抑制均可重現(xiàn)保護(hù)性表型，在體內(nèi)抑制NETosis和肺損傷。
總之，本研究揭示了一個(gè)全新的METTL3-SYK表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控軸，對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷過(guò)程中的中性粒細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。以上結(jié)果提示m6A依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可作為ALI和膿毒癥相關(guān)炎癥的潛在治療靶點(diǎn)。
  圖形摘要：METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在促進(jìn)SYK表達(dá)、NETosis和中性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的肺損傷中的作用。METTL3的藥理學(xué)抑制可抑制該軸，減輕ALI和膿毒癥中的炎癥和血管損傷。
 
易小結(jié)
本研究將RNA m6A修飾這一動(dòng)態(tài)可逆的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制與中性粒細(xì)胞效應(yīng)功能直接關(guān)聯(lián)，開(kāi)辟了“代謝-表觀遺傳-免疫效應(yīng)”三位一體的研究新思路，不僅具有重大科學(xué)創(chuàng)新價(jià)值，更展現(xiàn)出向臨床轉(zhuǎn)化的廣闊前景。

研究創(chuàng)新性地應(yīng)用MeRIP-seq技術(shù)對(duì)中性粒細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾進(jìn)行測(cè)序分析，為解析免疫細(xì)胞功能調(diào)控的表觀轉(zhuǎn)錄組機(jī)制提供了可復(fù)制的技術(shù)路線，未來(lái)可拓展至其他免疫細(xì)胞類(lèi)型及炎癥性疾病的研究中，具有重要的方法學(xué)參考。

研究方法
（1）模型構(gòu)建

• 髓系特異性（Lyzm-Cre）和中性粒細(xì)胞特異性（Ly6G-Cre）的條件性METTL3敲除小鼠（M3cKO）。
• 使用脂多糖（LPS）氣管內(nèi)滴注誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷（ALI）模型。
• 使用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）手術(shù)構(gòu)建膿毒癥模型。
• 從小鼠骨髓或肺組織中分離原代中性粒細(xì)胞。
• 使用人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60，經(jīng)DMSO誘導(dǎo)分化為中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞（dHL-60）進(jìn)行體外研究。

（2）表型與功能分析

• 流式細(xì)胞術(shù)：分析中性粒細(xì)胞（Ly6G+CD11b+）浸潤(rùn)、SYK及TLR2蛋白表達(dá)水平。
• 組織病理學(xué)：H&E染色評(píng)估肺損傷評(píng)分。
• NETs檢測(cè)： 免疫熒光顯微鏡（Sytox Green/DAPI/H3Cit染色）可視化NETs；ELISA檢測(cè)血漿MPO-DNA復(fù)合物；Western Blot檢測(cè)瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）。
• 血管通透性：伊文思藍(lán)染料滲出實(shí)驗(yàn)。
• 酶活性與產(chǎn)物：髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性檢測(cè)、活性氧（ROS）檢測(cè)。
• 吞噬功能：熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)。

（3）機(jī)制研究和驗(yàn)證：

• MeRIP-seq（m6A-seq）：對(duì)野生型和METTL3敲除中性粒細(xì)胞的總RNA進(jìn)行m6A測(cè)序，在全基因組范圍鑒定差異m6A修飾峰及潛在靶基因。發(fā)現(xiàn)SYK為關(guān)鍵靶點(diǎn)。
• MeRIP-qPCR：對(duì)MeRIP-seq篩選出的候選靶點(diǎn)（如SYK、TLR2）進(jìn)行驗(yàn)證，定量特定轉(zhuǎn)錄本上的m6A富集程度。
• RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理細(xì)胞，通過(guò)qPCR追蹤SYK mRNA的衰減速率，驗(yàn)證m6A修飾對(duì)其穩(wěn)定性的影響。
• 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)： 構(gòu)建包含SYK mRNA野生型或m6A位點(diǎn)突變型3'UTR的報(bào)告基因載體，驗(yàn)證m6A修飾對(duì)其報(bào)告基因活性的影響。
• Western Blot：檢測(cè)METTL3、SYK及其磷酸化形式、ERK/MEK及其磷酸化形式、H3Cit等關(guān)鍵蛋白表達(dá)。
• Dot Blot：檢測(cè)全RNA m6A修飾整體水平。
• qPCR：檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平。

研究結(jié)果
（1）METTL3敲除可減輕急性肺損傷（ALI）中的中性粒細(xì)胞募集和肺損傷
研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確立了METTL3在ALI病理中的關(guān)鍵作用。研究人員構(gòu)建了中性粒細(xì)胞特異性METTL3敲除（M3cKO）小鼠，并給予LPS誘導(dǎo)ALI。結(jié)果顯示，與野生型（WT）小鼠相比，M3cKO小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少（圖1B-D）。

組織病理學(xué)H&E染色表明，M3cKO小鼠肺部炎癥、水腫和肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，肺損傷評(píng)分下降（圖1F-G）。此外，M3cKO小鼠肺血管通透性顯著降低（圖1E），提示內(nèi)皮屏障損傷減輕。與NETs形成相關(guān)的標(biāo)志物也同步下降：肺組織MPO活性降低（圖1H），瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）水平減少（圖1J）。上述數(shù)據(jù)綜合表明，METTL3是LPS誘導(dǎo)的ALI中中性粒細(xì)胞募集、激活和相關(guān)肺損傷所必需的。
   
（2）中性粒細(xì)胞METTL3在體外促進(jìn)NETs形成
隨后，研究人員將表型研究深入至細(xì)胞水平，并建立m6A修飾與NETosis的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠或PMA刺激的骨髓源性中性粒細(xì)胞（BMNeu）中，整體m6A RNA修飾水平以及METTL3蛋白表達(dá)均上調(diào)（圖2C-E）。在體外，使用METTL3抑制劑STM2457處理分化后的HL-60細(xì)胞，或直接使用M3cKO小鼠的原代BMNeu，結(jié)果顯示經(jīng)PMA刺激后，NETs形成被顯著抑制（圖2F-I）。同時(shí)，NETosis的下游事件，如MPO活性、ROS產(chǎn)生和H3Cit水平，在METTL3敲除細(xì)胞中也均減弱（圖2J-M）。

上述研究結(jié)果直接證明METTL3對(duì)中性粒細(xì)胞NETosis程序具有正向調(diào)控作用。
 
（3）METTL3通過(guò)SYK/ERK/MEK信號(hào)軸促進(jìn)NETosis
接下來(lái)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行核心的分子機(jī)制探索。首先，Dot blot分析證實(shí)，METTL3敲除導(dǎo)致中性粒細(xì)胞中m6A修飾減少（圖3A）。為闡明METTL3如何調(diào)控NETosis，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了MeRIP-seq分析。差異m6A peaks富集分析揭示了ERK/MAPK通路和ROS產(chǎn)生的顯著變化，這兩者是NETs形成的關(guān)鍵（圖3B）。維恩圖富集分析鑒定出SYK、TLR4和Ptk2b三個(gè)候選基因（圖3C）。

qPCR證實(shí)，只有SYK（一種非受體酪氨酸激酶，中性粒細(xì)胞激活所必需）在METTL3敲除（M3cKO）中性粒細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖3D）。SYK mRNA和蛋白表達(dá)在METTL3 cKO BMNeu和METTL3敲低dHL-60中在基礎(chǔ)水平和PMA處理后均顯著降低（圖3E-G）。

為確認(rèn)SYK在NETosis中的重要性，研究團(tuán)隊(duì)用SYK磷酸化抑制劑R406預(yù)處理BMNeu和dHL-60。該處理顯著減少原代骨髓中性粒細(xì)胞和dHL-60細(xì)胞中的NETs形成，表現(xiàn)為SYTOX染色減少和H3Cit水平降低。此外與對(duì)照組相比，NETosis過(guò)程中METTL3敲除（M3cKO）中性粒細(xì)胞和METTL3敲低dHL-60中的ERK/MEK活性顯著降低（圖3F）。重要的是，在siMETTL3 dHL-60細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SYK增加了PMA誘導(dǎo)的SYK磷酸化水平（圖3H），并恢復(fù)PMA刺激后的NETs形成（圖3I-J）。

上述分析數(shù)據(jù)證實(shí)SYK是METTL3的直接m6A靶點(diǎn)，并通過(guò)SYK/ERK/MEK信號(hào)軸調(diào)控NETosis。
   
（4）METTL3依賴(lài)的SYK表達(dá)加劇膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷
研究團(tuán)隊(duì)在更復(fù)雜的膿毒癥（CLP）模型和體內(nèi)挽救實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了上述軸線的病理相關(guān)性。在LPS或CLP誘導(dǎo)的損傷中，M3cKO小鼠肺部浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞的SYK表達(dá)低于WT小鼠（圖4A-B）。關(guān)鍵的挽救實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)慢病毒在M3cKO小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)SYK，可逆轉(zhuǎn)其保護(hù)效應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷加重、H3Cit水平回升（圖4C-G）。反之，藥理學(xué)抑制SYK（R406）則可減輕WT小鼠的ALI，降低肺損傷評(píng)分、血管滲漏、MPO活性和H3Cit水平（圖4H-K）。研究還發(fā)現(xiàn)METTL3可能通過(guò)SYK間接調(diào)控TLR2表達(dá)（圖4L-P）。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果強(qiáng)有力地表明，METTL3-SYK軸是膿毒癥相關(guān)ALI的重要促進(jìn)因子。
   
（5）METTL3通過(guò)m6A修飾穩(wěn)定SYK mRNA
為進(jìn)一步研究METTL3調(diào)控SYK表達(dá)的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)使用MeRIP-seq分析了SYK轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾。在WT中性粒細(xì)胞中鑒定到SYK mRNA 3'UTR中的顯著m6A peaks，在METTL3敲除細(xì)胞中顯著降低（圖5A）。MeRIP-qPCR證實(shí)SYK轉(zhuǎn)錄本在WT細(xì)胞中先甲基化（圖5B）。
定量PCR顯示，PMA刺激后METTL3敲除中性粒細(xì)胞中SYK mRNA水平較低（圖5C）。為區(qū)分轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了放線菌D追蹤實(shí)驗(yàn)。SYK mRNA在METTL3敲除細(xì)胞中降解更快，表明METTL3延長(zhǎng)了SYK轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性（圖5D-E）。相比之下，新生RNA標(biāo)記顯示SYK轉(zhuǎn)錄僅適度降低（圖5F）。

使用野生型或突變型SYK 3'UTR的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，m6A位點(diǎn)缺失顯著降低了報(bào)告基因活性（圖5G）。這些數(shù)據(jù)共同證明，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定了SYK mRNA，支持NETs形成所需的持續(xù)蛋白表達(dá)和下游信號(hào)。
   
（6）藥理學(xué)抑制METTL3可抑制NETosis并改善肺部預(yù)后
為評(píng)估靶向METTL3的治療潛力，研究團(tuán)隊(duì)在LPS誘導(dǎo)ALI前用METTL3抑制劑STM2457預(yù)處理WT小鼠。STM2457處理顯著降低了肺組織和分選血液中性粒細(xì)胞中的m6A水平（圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，STM2457處理小鼠肺組織中性粒細(xì)胞積累顯著減少（圖6B-C）。組織學(xué)分析顯示STM2457處理小鼠肺形態(tài)改善，肺泡塌陷和炎癥浸潤(rùn)減少（圖6D-E）。Evans藍(lán)染料定量的肺血管滲漏也顯著降低（圖6F）。流式細(xì)胞術(shù)顯示STM2457降低了肺組織中SYK表達(dá)水平和SYK陽(yáng)性中性粒細(xì)胞百分比（圖6G-I）。生化分析證實(shí)處理后肺組織中MPO活性和H3Cit表達(dá)降低（圖6J-K），提示抑制METTL3破壞了ALI中NETosis和炎癥涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路。
上述研究結(jié)果證明，METTL3的藥理學(xué)抑制減弱了NETs形成、中性粒細(xì)胞激活和肺損傷，具有治療ALI和膿毒癥的潛在價(jià)值。
 
結(jié)論和啟示
本研究通過(guò)條件性基因敲除、藥理學(xué)干預(yù)、細(xì)胞生物學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（MeRIP-seq）等綜合分析方法，系統(tǒng)闡明了METTL3-SYK-ERK/MEK軸在ALI中的核心作用。關(guān)鍵結(jié)論包括：

• METTL3通過(guò)m6A修飾穩(wěn)定SYK mRNA，延長(zhǎng)其半衰期；
• SYK持續(xù)表達(dá)激活ERK/MEK信號(hào)，驅(qū)動(dòng)ROS產(chǎn)生和NETosis；
• 遺傳學(xué)和藥理學(xué)抑制METTL3均可減輕ALI病理表現(xiàn)。

MeRIP-seq在本研究中的重要作用
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)比較WT與METTL3敲除中性粒細(xì)胞的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)繪制了m6A修飾圖譜。MeRIP-seq技術(shù)不僅幫助將表型關(guān)聯(lián)到ERK/MAPK等正確通路，更重要的是直接、精準(zhǔn)地篩選出SYK作為METTL3的關(guān)鍵m6A修飾靶點(diǎn)。

關(guān)于易基因RNA m⁶A甲基化測(cè)序(MeRIP-seq)技術(shù)
易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m⁶A特異性抗體富集發(fā)生m⁶A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的m⁶A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m⁶A檢測(cè)。

大樣本量m⁶A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個(gè)樣品價(jià)格高，通常難以承擔(dān)。易基因開(kāi)發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實(shí)現(xiàn)不同樣本間相對(duì)定量，降低檢測(cè)成本。

易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：

• m⁶A甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）
• m⁶A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-MeRIP-seq）
• m⁶A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
• 高通量m⁶A甲基化-常量mRNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq2）

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
• 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；
• 樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m⁶A檢測(cè)；
• 重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，最大化降低抗體富集偏差；
• 應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。

研究方向：
m⁶A甲基化目前主要運(yùn)用在分子機(jī)制的理論性研究

• 疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾�。ㄈ绶逝�/糖尿�。�、神經(jīng)和精神疾�。ㄈ绨�爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
• 發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個(gè)體/組織/器官生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞分化與命運(yùn)決定、衰老
• 環(huán)境暴露與響應(yīng)：污染、抗逆、生活方式

關(guān)于m⁶A甲基化研究思路
（1）整體把握m⁶A甲基化圖譜特征：m⁶A peak數(shù)量變化、m⁶A修飾基因數(shù)量變化、單個(gè)基因m⁶A peak數(shù)量分析、m⁶A peak在基因元件上的分布、m⁶A peak的motif分析、m⁶A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m⁶A peak和基因：差異m⁶A peak鑒定、非時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m⁶A修飾基因的功能分析、差異m⁶A修飾基因的PPI分析、候選基因的m⁶A修飾可視化展示
（3）m⁶A甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析：Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)、m⁶A修飾目標(biāo)基因的篩選策略
（4）進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)
   
參考文獻(xiàn)：Luo S, Zhang Q, Zhou W, Zhang L, Liao C, Zeng D, Zhang L, Xiang FL, Xu J, Tang J. METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury. J Adv Res. 2026 Jan 22. doi: 10.1016/j.jare.2026.01.044.