蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備和具體操作流程詳解

實(shí)驗(yàn)前需確定樣本中是否表達(dá)目的蛋白。
通常會(huì)參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行樣本的選擇，常用的數(shù)據(jù)庫(kù)如下：

（1）網(wǎng)址：https://www.proteinatlas.org/，簡(jiǎn)稱 HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)，提供人類(lèi)蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞系中的表達(dá)和定位信息。

（2）網(wǎng)址：https://www.phosphosite.org/，蛋白質(zhì)翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫(kù)，查閱修飾類(lèi)蛋白的表達(dá)條件和豐度、刺激方式等。

（3）網(wǎng)址：http://biogps.org/，可以查詢?nèi)恕⑿∈�、大鼠中某種蛋白的 mRNA 表達(dá)水平。

編碼蛋白的基因在表達(dá)以后，通常還需不同翻譯后修飾（post-translation modifications, PTMs）如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化等，才能獲得正常的結(jié)構(gòu)與功能。這些翻譯后修飾過(guò)程受多種修飾酶和去修飾酶等的嚴(yán)格調(diào)控，使得蛋白在特定瞬間或時(shí)期背景下呈現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定或動(dòng)態(tài)可逆的功能狀態(tài)。

在進(jìn)行蛋白檢測(cè)（如 WB）時(shí)，如果蛋白存在翻譯后修飾，結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)分子量大小與預(yù)期理論值不符、條帶彌散、多條帶或條帶較弱等情況。如糖基化修飾通常會(huì)導(dǎo)致蛋白表觀分子量大于預(yù)測(cè)值。

在蛋白提取和檢測(cè)過(guò)程中，為了最大程度保留目標(biāo)蛋白的天然修飾狀態(tài)并避免降解，實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加入蛋白酶抑制劑（防止蛋白被內(nèi)源性蛋白酶降解）以及磷酸酶抑制劑（防止已存在的磷酸化修飾被去除），必要時(shí)還可根據(jù)研究對(duì)象選擇相應(yīng)的去乙酰化酶抑制劑或其他特異性抑制劑（如激酶抑制劑）。抑制劑添加能夠有效保證目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性與修飾完整性，從而獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

常用查詢數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：https://www.uniprot.org/，可查詢目的蛋白的基因名、別名、功能、可變剪切體、亞細(xì)胞定位及可能的翻譯后修飾類(lèi)型等信息，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析提供參考。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)/文獻(xiàn)查詢靶蛋白是否有異構(gòu)體以及可變剪切體。如果存在，此類(lèi)結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致 WB 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)多條蛋白條帶。為避免遺漏重要信息，建議首次實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量保留完整膜片進(jìn)行檢測(cè)。

目的：細(xì)胞裂解是蛋白樣本制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目的是釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，以便后續(xù)檢測(cè)。

• 對(duì)于貼壁細(xì)胞：用 4℃ 預(yù)冷的 PBS Buffer (1×) 洗 2~3 遍，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用 EDTA 溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡可能吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。細(xì)胞樣品按 1×10⁶ 細(xì)胞數(shù)加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超聲儀冰浴超聲 20 s）。

• 對(duì)于懸浮細(xì)胞：用 PBS 洗 2~3 遍，離心收集細(xì)胞，盡可能吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。細(xì)胞樣品按 1×10⁶ 細(xì)胞數(shù)加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超聲儀冰浴超聲 20 s）。

• 對(duì)于組織樣品：剪取適量組織和蛋白裂解液于勻漿器中磨勻（0.01 g 組織加上 50-100 μL 的蛋白裂解液），直至看不見(jiàn)組織塊。將組織樣品勻漿液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管中，置于冰上蛋白裂解 15 min。12000 rpm，4℃ 離心 10 min，立即吸取上清至一預(yù)冷的 1.5 mL EP 管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱 PAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在蛋白質(zhì)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)；在 DNA 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA 呈雙鏈狀態(tài)泳動(dòng)，其遷移率會(huì)受堿基組成和序列的影響。

在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，由于加入了變性劑——蛋白質(zhì)變性劑常為 SDS（SDS-PAGE），核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等，故其分離僅依據(jù)于分子量大小。

在高電壓的作用下，所有孔道中的蛋白會(huì)同時(shí)開(kāi)始向下遷移，分子量大的蛋白，阻力大，位置靠上，分子量小的蛋白則靠下，示意圖如下：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和蛋白特性，選擇合適的 SDS-PAGE 蛋白質(zhì)上樣緩沖液制備還原樣本或非還原樣本，以滿足不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析要求。

盡量保持每個(gè)泳道的蛋白量一樣，體積盡量一致，空置的泳道用等體積的 1× 上樣緩沖液補(bǔ)齊，以避免由于凝膠受力不均而導(dǎo)致最后的一兩個(gè)樣品條帶出現(xiàn)上揚(yáng)現(xiàn)象。

目的：蛋白質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE 分離后，必須及時(shí)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物能牢固結(jié)合蛋白又不影響其抗原活性，這使其比直接在凝膠上檢測(cè)更易操作。

目前常用的膜有 PVDF 膜和 NC 膜，其主要區(qū)別如下：