利用Cytiva HyClone無動物源合規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行工藝放大并提升rAAV5表達(dá)

Cytiva（思拓凡）——HyClone™ peak expression 培養(yǎng)基

HyClone™ peak expression 培養(yǎng)基是一種無動物源性成分 (ADCF)、無水解物且監(jiān)管友好的細(xì)胞培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的用途廣泛，可提高轉(zhuǎn)染效率，確保細(xì)胞生長一致，提高活細(xì)胞密度，并具有優(yōu)異的病毒滴度，適用于多種 HEK 293 細(xì)胞系和 AAV 血清型。HyClone™ peak expression 培養(yǎng)基為支持出色性能的小規(guī)模和大規(guī)模生產(chǎn)工藝使用而生，使用標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化細(xì)胞系和工藝，可支持從細(xì)胞生長到AAV生產(chǎn)的無縫過渡。HyClone™ peak expression 培養(yǎng)基有液體和粉末兩種規(guī)格，并采用用戶友好型包裝。

HyClone Peak Expression培養(yǎng)基是一款專為培養(yǎng)HEK293細(xì)胞生產(chǎn)rAAV所設(shè)計的產(chǎn)品。

該培養(yǎng)基以下特征：

無動物源性成分（ADCF）

無血清，無水解物

含穩(wěn)定型谷氨酰胺及泊洛沙姆188

支持高密度細(xì)胞生長

提升轉(zhuǎn)染效率和病毒包裝能力

配制步驟：

1 、室溫條件下（20℃-25℃），在潔凈容器中加入終體積90%的細(xì)胞培養(yǎng)級純水（例如配制1L的Peak Expression 液體培養(yǎng)基，在容器中先加入900ml純化水），并開始攪拌。

2 、沿漩渦中心緩慢加入25.17 g/L Peak Expression干粉培養(yǎng)基，以避免結(jié)團(tuán)。攪拌20分鐘直至所有干粉溶解。

3 、緩慢加入2.5 g/L碳酸氫鈉。攪拌10分鐘直至所有干粉溶解。

注：此步驟后溶液呈淡黃色，無顆粒。在調(diào)節(jié)pH之前，溶液可能呈輕微渾濁。

4 、用5 N NaOH或HCl逐滴加入，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.4。

5 、加入細(xì)胞培養(yǎng)級純水，定容至終體積。

6 、測定最終pH和滲透壓：pH須在7.0-7.4之間，滲透壓須在300至340 mOsm/Kg之間。

7 、使用0.2 µm濾器進(jìn)行除菌過濾。

8 、2℃-8℃避光保存。

案例分享：使用HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基提升rAAV5的表達(dá)以及工藝放大
實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞株馴化

使用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基通過對 HEK 293.2 sus 細(xì)胞 (ATCC) 進(jìn)行直接馴化。種子細(xì)胞培養(yǎng)從原培養(yǎng)基中直接接種至HyClone Peak Expression，接種密度為 5.0 × 105 個細(xì)胞/mL。每 3 至 4 天在進(jìn)行傳代，連續(xù)培養(yǎng)12代以上，直至細(xì)胞的群體倍增時間 (PDT)達(dá)到24 到 30 小時之間，并且細(xì)胞活率高于90%。

搖瓶培養(yǎng)

將 HEK293.2 sus 細(xì)胞接種于裝有 30 到 50 mL HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基的 125 mL 搖瓶中，接種密度為 0.4 ×106 個細(xì)胞/mL。在振蕩培養(yǎng)箱中以 140 rpm、37°C 和 5% CO2 的條件進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞計數(shù)和活率下降到一定程度時終止培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)按三次重復(fù)進(jìn)行。

病毒增殖和滴度測定

通過三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該系統(tǒng)由一個遞送腺病毒基因的 pHelper 質(zhì)粒、一個 Rep/Cap（復(fù)制和衣殼蛋白）質(zhì)粒和另一個在末端反向重復(fù)序列 (ITR) 之間包含有目的基因（GOI，在本研究中是指綠色熒光蛋白 [GFP]）的質(zhì)粒組成，這三個質(zhì)粒對于將目的基因包裝到 AAV 衣殼中必不可少。helper: Rep/Cap: GOI 質(zhì)粒的比例為 2.0:1.5:1.0。在密度為 2 × 106 個細(xì)胞/mL 的培養(yǎng)物中，以 2:1（PEI 比 DNA）的比例使用線性化聚乙烯亞胺 (PEI, Polysciences Inc.) 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染。收獲時間 (TOH) 為轉(zhuǎn)染后第 4 天，通過微滴式數(shù)字 PCR (ddPCR) 檢測綠色熒光蛋白 (GFP) 轉(zhuǎn)基因盒，從而確定病毒滴度。

采用 100 μL 的 10× 裂解緩沖液（5% Tween 20、10 mM 氯化鎂、200 mM Tris，pH 8.0）和 20 U/mL Turbonuclease 酶在搖床中對大約 900 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行處理（37 ℃，持續(xù) 4 小時）。將等分試樣以 15000 × g 離心 10 分鐘，并對粗裂解上清液進(jìn)行 ddPCR 分析。

生物反應(yīng)器培養(yǎng)

以 0.5 × 106 個細(xì)胞/mL 的密度將 HEK 293.2 sus 細(xì)胞接種于裝有HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基的一次性 Xcellerex XDR-10 L 細(xì)胞培養(yǎng)袋中，生物反應(yīng)器的最終批體積為 9 L。使用表 1 中列出的培養(yǎng)參數(shù)，在 XDR-10 生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞從搖瓶移到 WAVE 生物反應(yīng)器（Xuri 細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng) W25）中，再移到 XDR-200 生物反應(yīng)器中，以此進(jìn)行擴(kuò)增。

結(jié)果

在連續(xù)傳代過程中，我們在搖瓶中用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基培養(yǎng)了不同代次的細(xì)胞，培養(yǎng)時間最長達(dá) 13 天。對 VCD、細(xì)胞活力和 PDT 進(jìn)行全程監(jiān)測。我們可以從下圖 中看出，細(xì)胞生長密度范圍在 6.0 至 9.0 × 106 個細(xì)胞/mL 之間。

轉(zhuǎn)染條件

采用三重質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法對已馴化的 HEK293.2 懸浮細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。在該過程中，線性化聚乙烯亞胺 (PEI) 與 DNA 形成復(fù)合物，然后被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。使用綠色熒光蛋白 (rAAV5-GFP) 對搖瓶中的 HEK293.2.sus細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒的使用量為 每2 × 106個細(xì)胞對應(yīng) 2 μg DNA。

為研究該培養(yǎng)基對 PEI-DNA 復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，測試了轉(zhuǎn)染復(fù)合物在HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基中的占比（占rAAV生產(chǎn)總體積的5% 或10%）。每種條件按三次重復(fù)在搖瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示 占比為10% 時，一致性較好，因此在使用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基的rAAV 生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，推薦使用該體積。

rAAV產(chǎn)率提升

我們評估了 rAAV5 在兩種不同培養(yǎng)基（HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基和原培養(yǎng)基）中的產(chǎn)率。滴度測定結(jié)果以 GC/L（基因組拷貝數(shù)/升）為單位，對四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。

我們發(fā)現(xiàn)與原培養(yǎng)基相比，使用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基時的滴度 (GC/L) 增長至 4 倍 (p < 0.05)，如下圖所示。使用 原培養(yǎng)基時的收率（GC/細(xì)胞）為 2.6 × 104 GC/細(xì)胞，而在使用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基的樣品中，我們觀察到收率為 6.8 × 104 GC/細(xì)胞，相當(dāng)于增長至兩倍多，未顯示相關(guān)數(shù)據(jù)。

在生物反應(yīng)器中放大 rAAV5 生產(chǎn)

最后，我們將 rAAV5-GFP 的生產(chǎn)進(jìn)行了放大，由搖瓶培養(yǎng)改為用 10 L 規(guī)格的 Xcellerex XDR-10 生物反應(yīng)器培養(yǎng)，然后用 200 L 規(guī)格的 XDR-200 生物反應(yīng)器進(jìn)一步放大培養(yǎng)。結(jié)果顯示，雖然相較與搖瓶培養(yǎng)的產(chǎn)率稍有下降，但總體來說該工藝可在 10 L 至 200 L 生物反應(yīng)器之間進(jìn)行放大。GFP 的百分比峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第 48 小時（未顯示相關(guān)數(shù)據(jù)）。

培養(yǎng)基中的泊洛沙姆對rAAV產(chǎn)率的影響

為避免聚集，對抗剪切損傷，并促進(jìn)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生長，通常在生長培養(yǎng)基中使用泊洛沙姆。盡管收率沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)，在 PEI 和 DNA 復(fù)合物中未添加 Pluronic F-68 的情況下，rAAV 產(chǎn)率低于 1.8 × 1014 GC/L，反之，rAAV 產(chǎn)率高于 1.8 × 1014 GC/L。

結(jié)論

我們對于思拓凡的 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基的觀察結(jié)果如下：

HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基具有完整的補(bǔ)料成分，無需額外添加其他培養(yǎng)物料，因而其上游工藝簡單而穩(wěn)健，可重現(xiàn)性更好。

細(xì)胞經(jīng)過冷凍保存后復(fù)蘇良好，培養(yǎng)條件穩(wěn)定。

在搖瓶中的高密度培養(yǎng)可達(dá)到 9.0 × 106 個細(xì)胞，可進(jìn)行 rAAV 批量生產(chǎn)。

采用 HyClone Peak Expression 培養(yǎng)基可以將工藝規(guī)模從搖瓶放大至 200 L。

我們發(fā)現(xiàn)，與原培養(yǎng)基相比，rAAV 收率增長至 4 倍。

當(dāng)占生產(chǎn)體積 10% 時 DNA-PEI 復(fù)合物一致性較好。

泊洛沙姆對 DNA-PEI 復(fù)合物的形成及后續(xù)轉(zhuǎn)染沒有影響。

 

綜上所述，Cytiva（思拓凡）作為生物制藥領(lǐng)域具備高合規(guī)資質(zhì)的頭部供應(yīng)商，其旗下HyClone™ Peak Expression培養(yǎng)基完全滿足“無動物源”核心要求——明確標(biāo)注無動物源性成分（ADCF）、無血清、無水解物，從源頭規(guī)避了動物源污染風(fēng)險；同時，該產(chǎn)品具備監(jiān)管友好的配方設(shè)計，適配從搖瓶到200L生物反應(yīng)器的規(guī)模化生產(chǎn)，且品牌依托成熟的質(zhì)量控制體系（符合生物制藥領(lǐng)域嚴(yán)苛的生產(chǎn)規(guī)范），可提供完整的合規(guī)性支持文件，充分契合“符合藥典標(biāo)準(zhǔn)”的應(yīng)用需求。
無論是基因治療中rAAV的高效生產(chǎn)，還是其他對培養(yǎng)基安全性、一致性有嚴(yán)格要求的生物制藥場景，Cytiva（思拓凡）的HyClone™ Peak Expression培養(yǎng)基都是兼具可靠性與實(shí)用性的優(yōu)選方案，其品牌資質(zhì)與產(chǎn)品性能均能為相關(guān)生產(chǎn)工藝的合規(guī)性、穩(wěn)定性提供有力保障。