利用384孔格式的ELISPOT檢測法進行腫瘤免疫監(jiān)測

摘要

全面的免疫監(jiān)測需要測量產(chǎn)生不同細胞因子的T細胞頻率，以確定細胞介導(dǎo)免疫中Th1、Th2和Th17成分的強度。抗原滴度檢測可提供關(guān)于T細胞反應(yīng)親和力的額外信息。在腫瘤免疫中，建議通過檢測多個表位來考慮決定簇擴散效應(yīng)。進行全面免疫監(jiān)測需要大量 PBMC 系統(tǒng)運行上述檢測，這在大多數(shù)檢測案例中是受限的。迄今為止，采用ELISPOT檢測法的免疫監(jiān)測已采用96孔板格式進行。本研究顯示，通過在膜表面積僅為96孔板三分之一的384孔板中進行檢測，可提高細胞利用率。對兩種格式中抗原特異性T細胞反應(yīng) PBMC 的系統(tǒng)測試表明，384孔板檢測相當(dāng)于96孔板檢測的三分之一微型化。在384孔板格式中，允許與抗原呈遞細胞充分接觸的最低可用細胞數(shù)為33,000個 PBMC /孔。因此，通常從1 mL血液中獲取的100萬個 PBMC ，可在384孔板格式中進行30孔T細胞ELISPOT檢測。

1. 引言

T淋巴細胞是機體抵御癌癥及各類感染的主要防御細胞。監(jiān)測T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)面臨兩大挑戰(zhàn)：其一，這些細胞分化為多種效應(yīng)細胞亞群，分泌不同且通常互斥的效應(yīng)分子；其二，只有全面評估所有亞群，才能揭示T細胞免疫的真實特性[1]。另一個挑戰(zhàn)在于，T細胞常同時靶向多種抗原/肽段，必須對所有抗原進行檢測才能準確評估免疫反應(yīng)強度�？乖�效價測定可反映T細胞反應(yīng)的親和力。因此，采用ELISPOT技術(shù)的全面免疫監(jiān)測需檢測多種分析物及測試條件。臨床試驗方案通常要求同步進行多項細胞檢測，這會增加額外的細胞損耗。理想情況下， PBMC 應(yīng)冷凍保存以供批量檢測，但這會導(dǎo)致更多細胞損失�；�于上述原因，受試者可獲取的細胞數(shù)量往往成為細胞免疫監(jiān)測的限制因素，尤其在涉及兒童、老年、免疫抑制或腫瘤受試者的試驗中更為明顯。

目前尚無單一檢測方法能全面測量T細胞免疫的所有相關(guān)參數(shù)。ELISPOT檢測可揭示抗原反應(yīng)性Th1、Th2及Th17細胞的頻率與細胞因子特征。通過雙色ELISPOT檢測（酶聯(lián)或熒光法）測量IL-2與 IFN - γ 的共表達，可提供與流式細胞術(shù)同等靈敏度的多功能T細胞數(shù)量信息，但所需細胞數(shù)量更少[2]。在體外抗原暴露24小時內(nèi)檢測到產(chǎn)生顆粒酶B（Granzyme B）和穿孔素（Perforin）的T細胞，表明CD8+效應(yīng)細胞近期在體內(nèi)被激活[3]。相反，若在體外抗原暴露24小時內(nèi)未檢測到產(chǎn)生顆粒酶B和穿孔素的T細胞，但在后續(xù)體外抗原刺激3-4天后檢測到這些細胞因子，則提示CD8+記憶細胞在體內(nèi)處于靜息狀態(tài)，但具有再激活后的細胞溶解潛能[4]。通過滴定測試抗原濃度可揭示T細胞對該抗原的親和力[5]，此類測量在腫瘤學(xué)及自身免疫試驗中尤為重要。

在酶標(biāo)孔板檢測中，每個接種的細胞都會被逐一檢測。這種檢測方式進一步提高了細胞利用率——細胞在檢測過程中不受影響地存活，可重復(fù)用于后續(xù)實驗[6,7]。然而， PBMC 數(shù)量常成為免疫監(jiān)測的瓶頸。為減少 PBMC 使用量，近期研究采用了一種新型酶標(biāo)孔板檢測法：先在384孔板和1536孔板中用抗原預(yù)激活細胞，再轉(zhuǎn)移至常規(guī)96孔酶標(biāo)孔板中測定細胞因子產(chǎn)生細胞數(shù)量[8]。由于此類細胞轉(zhuǎn)移操作易出錯且耗時費力，我們驗證了是否可通過直接將 PBMC 接種于專用384孔酶標(biāo)孔板（其膜表面積 PVDF 常規(guī)96孔板）來實現(xiàn)檢測。需注意的是，這類384孔板的膜表面積僅為常規(guī)96孔板的三分之一（按孔數(shù)推算應(yīng)為四分之一）。鑒于酶標(biāo)孔板檢測依賴于單層T細胞的抗原呈遞細胞（APC）接觸檢測，我們推測384孔板檢測所需的試劑（包括細胞材料）用量可精確控制在96孔板的三分之一。

2. 實驗部分

2.1. 外周血單個核細胞

本研究使用的人源 PBMC 取自健康供體，這些供體選自Cellular Technology Ltd公司的參考數(shù)據(jù)庫[9]。所有供體均經(jīng)過HLA分型檢測，并預(yù)先表征了T細胞活性。細胞解凍采用優(yōu)化方案[10]：將冷凍管置于氮氣蒸氣中保存，隨后放入37°C玻璃珠浴槽中處理10分鐘（CTL -BB-001， CTL ，美國俄亥俄州克利夫蘭）。使用預(yù)熱至37°C的 CTL 抗聚集培養(yǎng)基（貨號 CTL -AA-005， CTL ，美國俄亥俄州克利夫蘭）緩慢稀釋細胞。 PBMC 離心10分鐘后，棄去上清液，輕敲細胞沉淀使其重懸，再加入抗聚集培養(yǎng)基。使用 CTL 的活/死/凋亡細胞計數(shù)平臺（貨號 CTL - LDAC -100）對細胞樣本進行活細胞計數(shù)。計數(shù)完成后再次離心，將細胞重懸于適量 CTL 檢測培養(yǎng)基（貨號 CTLT -005， CTL ，美國俄亥俄州克利夫蘭），按實驗要求接種相應(yīng)數(shù)量的人源 PBMC 。

2.2. 人 IFN - γ ELISPOT檢測

384孔和96孔的ELISPOT檢測均使用Cellular Technology Ltd.公司的人 IFN - γ 試劑盒（96孔試劑盒貨號hIFNG-1M/5,384孔試劑盒貨號hIFNG-3M/5）進行。所有抗體、三抗、稀釋液和底物均包含在試劑盒中。兩種類型的板均按照制造商的說明進行檢測。簡言之，板在過夜后用人 IFN - γ 包被抗體進行包被。次日，用PBS洗滌板一次，然后將HCMVpp65抗原（貨號CEF32-07-005）接種于 CTL -Test培養(yǎng)基中。96孔板接種 PBMC 后需100 µL ，384孔板需33 µL ，隨后將板置于37°C、7%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中。孵育24小時后，移除 PBMC ，并加入試劑盒中的檢測抗體和顯色試劑。完成ELISPOT檢測后，將板置于層流罩中風(fēng)干，再進行分析。

使用免疫斑點®S6Ultimate閱讀器（型號S6ULT9000， CTL ，美國俄亥俄州克利夫蘭）對酶標(biāo)儀斑點板進行掃描分析。免疫斑點®軟件通過SmartCount™和Autogate™功能，自動計算每種抗原刺激條件及陰性對照培養(yǎng)基中的斑點形成單位（SFU）[11]。

2.3. PBMC 的熒光檢測

PBMC 采用CalceinAM（貨號C3100MP，Invitrogen公司，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）進行染色，具體操作為將1.0×10⁶ PBMC /mL的細胞懸液與含1 µL 1mMCalceinAM染料的DMSO（Sigma公司，美國密蘇里州圣路易斯）在 CTL -Test培養(yǎng)基中孵育。孵育結(jié)束后，離心10分鐘并棄去上清液，隨后用 CTL -Test培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，最終用于實驗。

熒光檢測使用ImmunoSpot®S6UltimateReader（型號S6ULT9000， CTL ，美國俄亥俄州克利夫蘭）完成，激發(fā)波長設(shè)置為480nm，檢測波長采用520±20nm發(fā)射濾光片。

3. 結(jié)果與討論

3.1. CD8+細胞來源的 IFN - γ ELISPOT檢測顯示96孔板與384孔板中細胞大小分布一致

采用CEF肽段池刺激 PBMC 中的CD8+細胞，分別在96孔板和384孔板中平行進行人 IFN - γ 斑點實驗。由于384孔板的膜表面積僅為96孔板的三分之一，因此在384孔板中使用的 PBMC 數(shù)量及所有其他實驗試劑均減少三分之一。圖1A、B展示了96孔板和384孔板的代表性孔板圖像。肉眼觀察顯示斑點大小和密度相似，但為更嚴格比較兩種孔板的斑點尺寸，進行了圖像分析。96孔板和384孔板的圖像采用相同光學(xué)分辨率和數(shù)字分辨率采集，確�？蛇M行相似比較。兩種孔板的斑點尺寸分析均顯示為鐘形曲線，且均值和離散度相同（圖1C、D）。以對數(shù)尺度計算，96孔板和384孔板的平均斑點尺寸分別為−2.575和−2.514，標(biāo)準差分別為0.482和0.411。因此，兩種孔板的斑點尺寸等效，證明單個細胞的T細胞分泌活性不受孔板尺寸影響。

圖1。

96孔板與384孔板中 IFN γ 的斑點尺寸及分布完全一致。（A，B）分別以相同光學(xué)分辨率和數(shù)字分辨率拍攝96孔板與384孔板的對應(yīng)圖像；（C，D）將兩孔的斑點尺寸以直方圖形式呈現(xiàn)，并疊加紅色擬合對數(shù)正態(tài)曲線。

384孔板中的斑點尺寸分布與正態(tài)（高斯）函數(shù)的鐘形曲線高度吻合（圖1C、D）。為統(tǒng)計學(xué)驗證曲線是否符合正態(tài)分布，我們采用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫擬合優(yōu)度檢驗進行分析，設(shè)定顯著性水平 α =0.05。96孔板與384孔板的斑點尺寸p值分別為0.419和0.220。由于兩個p值均大于0.05的顯著性閾值，因此可判定斑點尺寸分布符合正態(tài)分布。

建立正常的斑點大小分布至關(guān)重要，因為這允許進行客觀計數(shù)。對于96孔板格式[12]以及384孔板，可通過將最小和最大斑點大小閾值設(shè)置為平均斑點大小的3個標(biāo)準差（SD）來實現(xiàn)基于統(tǒng)計學(xué)的自動化大小門控。當(dāng)斑點大小呈正態(tài)分布時，大于平均值3個SD的斑點（具有超過99.7%的置信度）源自細胞簇，需通過估算構(gòu)成該簇的斑點數(shù)量（即分泌分析物的細胞）進行計數(shù)。小于平均值3個SD的斑點（具有超過99.7%的確定性）代表檢測假象，必須通過門控排除。基于這些門控規(guī)則，我們比較了兩種板格式獲得的斑點計數(shù)。

3.2. 在384孔板和96孔板中，均觀察到 PBMC 數(shù)量與點形成單元（SFU）之間呈線性關(guān)系

在96孔板中，斑點數(shù)量與細胞數(shù)量之間的關(guān)系在每孔1.0×10⁵至1.0×10⁶個 PBMC 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系[13]，但超過或低于該細胞數(shù)量范圍時線性關(guān)系不再成立。為確保T細胞活化及隨之產(chǎn)生的細胞因子分泌，T細胞與抗原呈遞細胞（APC）必須在細胞膜上形成接觸。細胞數(shù)量與斑點計數(shù)的線性范圍表明：當(dāng)每孔接種少于1.0×10⁵個 PBMC 時，細胞間接觸無法實現(xiàn)；而當(dāng)接種量超過1.0×10⁶個時，細胞開始出現(xiàn)擁擠現(xiàn)象。在這兩個極端值之間， PBMC 應(yīng)能在細胞膜上形成單層結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)每個抗原特異性T細胞的活化與檢測。為驗證該假說，我們采用熒光染料對 PBMC 進行染色，并以十倍梯度稀釋法將其接種至96孔板中。如圖2所示，當(dāng)每孔接種1.0×10⁴個 PBMC 時，細胞分布過于分散，無法實現(xiàn)細胞間接觸；當(dāng)接種量為1.0×10⁵個時， PBMC 接近形成細胞間接觸的臨界密度；而當(dāng)接種量達到1.0×10⁶個時，細胞開始出現(xiàn)過度擁擠，不再維持單層結(jié)構(gòu)。因此，96孔板格式下細胞數(shù)量/斑點計數(shù)的線性數(shù)據(jù)與單層假說相符。

圖2。

PBMC 經(jīng)熒光CalceinAM染料染色后，將指定數(shù)量的細胞接種至96孔板相應(yīng)孔中。使用480nm激發(fā)波長的ImmunoSpot®S6UltimateReader讀板儀進行細胞成像，并通過520±20nm發(fā)射波長濾光片檢測熒光信號。

若單層假說成立，那么將 PBMC 以相同細胞密度接種至384孔板（即膜孔數(shù)為膜孔數(shù)三分之一）時，同樣會呈現(xiàn)斑點數(shù)與細胞數(shù)的線性關(guān)系，盡管每孔的斑點數(shù)僅為膜孔數(shù)的三分之一。

為探究384孔板中細胞數(shù)量/斑點計數(shù)的線性關(guān)系，將 PBMC 調(diào)整至1.5×10⁷個/mL，并進行12級梯度稀釋。將細胞平行接種于96孔板和384孔板中，分別用移液器將細胞懸液 100μL 至96孔板和33 μL 至384孔板。隨后采用 HCMV pp65抗原刺激CD8+細胞，進行人 IFN - γ 斑點實驗。結(jié)果如圖3所示：96孔板中，每孔1.0×10⁵個細胞與1×10⁶個細胞之間呈現(xiàn)近乎完美的線性關(guān)系（R²=0.9782）；384孔板中，當(dāng)接種量為上述數(shù)值的三分之一時，每孔3.3×10⁴個 PBMC 與3.5×10⁵個細胞之間也呈現(xiàn)近乎完美線性（R²=0.9823）。兩種孔板格式中，當(dāng)細胞密度高于或低于上述數(shù)值時，斑點計數(shù)與細胞數(shù)量的關(guān)系開始偏離線性。

圖3。

 

（A，B）PBMC 以指定數(shù)量進行連續(xù)稀釋后接種于酶標(biāo)儀檢測板，加入 HCMV pp65以誘導(dǎo)特異性CD8+細胞產(chǎn)生 IFN - γ 。向(B)384孔板添加的 PBMC 數(shù)量為(A)96孔板的三分之一。疊加的紅線顯示理想線性函數(shù)。對于96孔板，實驗數(shù)據(jù)在每孔1.0×10⁵個細胞至1×10⁶個細胞范圍內(nèi)近似符合線性關(guān)系（R²=0.9782）；對于384孔板，線性關(guān)系在每孔3.3×10⁴個 PBMC 至3.5×10⁵個細胞范圍內(nèi)近似成立（R²=0.9823）。

3.3. 384孔板重復(fù)孔中的點計數(shù)服從正態(tài)分布

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，當(dāng) PBMC 以相同密度接種時，384孔板的斑點計數(shù)應(yīng)為96孔板的三分之一，即每孔絕對數(shù)值的三分之一。由于96孔板重復(fù)孔之間存在固有變異性（研究顯示其遵循正態(tài)分布[14]），要直接比較96孔與384孔板的差異，最佳方法是驗證384孔板中重復(fù)孔的變異性是否遵循相同規(guī)律。此外，重復(fù)孔斑點計數(shù)的正態(tài)分布特性，使我們能夠通過參數(shù)統(tǒng)計方法比較抗原誘導(dǎo)斑點計數(shù)與培養(yǎng)基對照孔的數(shù)值，從而確定陽性反應(yīng)的判定閾值。

PBMC 在384孔板中進行測試，每孔接種5×10⁴個細胞（384個重復(fù)孔）和1.0×10⁵個細胞（192個重復(fù)孔）。兩種情況下均使用 HCMV pp65刺激CD8+細胞。采用Shapiro Wilk檢驗評估重復(fù)孔中的斑點計數(shù)是否符合正態(tài)分布。根據(jù)該檢驗，兩種細胞稀釋度的p值分別為0.708和0.388（α =0.05）。由于p值大于顯著性水平（α），重復(fù)孔中的斑點數(shù)量被認為符合正態(tài)分布。重復(fù)孔實驗斑點計數(shù)的Q-Q圖（圖4）呈線性，證實了Shapiro Wilk檢驗的結(jié)果。這證明384孔板重復(fù)孔中的斑點計數(shù)（如先前96孔板研究[14]所述）遵循正態(tài)分布函數(shù)。因此，在384孔板和96孔板檢測中，均可使用參數(shù)統(tǒng)計方法（包括Student‘s檢驗或方差分析）比較檢測結(jié)果。這也意味著無需采用經(jīng)驗性截斷值（例如96孔板中>10個斑點）來判定陽性與陰性反應(yīng)孔。既往研究中定義了“最小斑點數(shù)”以區(qū)分陽性與陰性反應(yīng)，因為這些細胞無法進行參數(shù)統(tǒng)計檢驗，而參數(shù)檢驗可明確區(qū)分二者。

圖4。

384孔板重復(fù)孔的點計數(shù)變異符合正態(tài)分布。 PBMC 接種于：(A)384個重復(fù)孔，每孔0.5×10⁵個細胞；(B)192個重復(fù)孔，每孔1.0×10⁵個細胞。采用 IFN - γ 斑點試驗檢測 HCMV pp65抗原的反應(yīng)。通過Shapiro-Wilk檢驗（α 值0.05，p值分別為0.708和0.388）確認數(shù)據(jù)正態(tài)性。實驗計數(shù)與理論計數(shù)的Q-Q圖如圖所示。

3.4. 384孔板中的 SFU 僅為96孔板的三分之一

我們采用平行實驗設(shè)計，對12份不同冷凍保存的 PBMC 樣本進行雙板格式檢測，其中11份樣本對 HCMV pp65呈陽性反應(yīng)。細胞以每孔3×10⁵ PBMC 的密度接種于96孔板（每個孔接種1.0×10⁵個細胞，每孔三復(fù)孔），并以三分之一體積（每孔1.0×10⁵個細胞）接種于384孔板（每個孔接種1.0×10⁵個細胞，每孔三復(fù)孔）。384孔板實驗中，其余試劑用量均按96孔板的三分之一比例使用。所有檢測結(jié)果均通過包含384孔板計數(shù)功能的ImmunoSpot®軟件（版本5.3.6）進行統(tǒng)計分析。如表1所示，11位陽性供體的96孔板平均 SFU 數(shù)（每孔三個復(fù)孔）約為384孔板平均菌落形成單位（SFU）的三倍。當(dāng)計算11位供體的平均值（三復(fù)孔數(shù)據(jù)的平均值）時，所得結(jié)果呈現(xiàn)近乎完美的1:3比例關(guān)系。

表1。

96孔板格式的斑點計數(shù)約為384孔板格式的三倍。對于11名受試者，HCMVpp65誘導(dǎo)的反應(yīng)在每種板格式中均進行三次重復(fù)孔測定，并顯示三次重復(fù)斑點計數(shù)的平均值。96孔板格式與384孔板格式的平均斑點計數(shù)比值顯示于右側(cè)列。

測試	96孔板	384孔	96W/384W
1	670.0	177.5	3.8
2	577.5	177.3	3.3
3	547.3	173.8	3.1
4	499.3	164.0	3.0
5	423.0	118.5	3.6
6	344.5	102.8	3.4
7	260.0	77.8	3.3
8	140.3	52.3	2.7
9	126.0	35.5	3.5
10	66.8	21.8	3.1
11	26.0	7.5	3.5
			平均值 3.3 ± 0.3

 

3.5. 96孔板與384孔板格式中觀察到匹配的劑量反應(yīng)曲線

為應(yīng)對可用測試樣本 PBMC 有限的問題，免疫監(jiān)測工作主要依賴單次抗原劑量下的T細胞反應(yīng)檢測。然而，此類檢測無法獲取T細胞對抗原功能親和力的關(guān)鍵信息，而該信息可通過抗原系列稀釋檢測來確定[5]。鑒于384孔板格式可使細胞使用量降低三倍，將親和力檢測納入T細胞監(jiān)測檢測中應(yīng)成為可能。

我們測試了在96孔板和384孔板中進行的T細胞功能親和力測量是否會產(chǎn)生相同的結(jié)果。將 PBMC 以每孔3×10^5個細胞的密度接種到96孔板中，以每孔1.0×10^5個細胞的密度接種到384孔板中。 HCMV pp65抗原的滴定范圍從10 µg /mL降至每孔1.0×10^-6 µg 。如圖5所示，兩種板型的劑量反應(yīng)曲線是平行的。曲線在96孔板中達到約360個斑點/孔，在384孔板中達到約105個斑點/孔。因此，96孔板中50%最大刺激的值為180個斑點/孔，384孔板中為53個斑點/孔。達到50%最大刺激的抗原濃度代表Keff50值，定義了親和力。兩種孔板格式的Keff50值幾乎相同，均為7.5ng/mL。數(shù)據(jù)顯示，384孔板檢測在測量T細胞功能親和力方面與96孔板檢測同樣有效，但僅需三分之一的細胞數(shù)量。

圖5。

在384孔和96孔板格式中進行的T細胞功能親和力測量結(jié)果相同。通過 PBMC 檢測了96孔和384孔板中CD8+細胞對 HCMV 肽pp65誘導(dǎo)的 IFN - γ 產(chǎn)生。測試的最高肽濃度為10 μg/mL，隨后進行1:10系列稀釋。96孔板中接種的 PBMC 數(shù)量為3×10^5/孔（綠線），384孔板中為1×10^5/孔（藍線）。最大激活50%的位置用紅色X標(biāo)記。

當(dāng)抗原進行系列稀釋時，通常無需設(shè)置重復(fù)孔，因為連續(xù)抗原濃度的系列孔可確認陽性反應(yīng)。384孔板格式的功能親和力測定，所需 PBMC 量可與常規(guī)96孔板單次抗原劑量測定相同或更少。在常規(guī)96孔板檢測中，單次抗原劑量下以每孔3×10⁵ PBMC 進行三重復(fù)孔抗原反應(yīng)性測試，需9×10⁵ PBMC 外加等量培養(yǎng)基對照 PBMC（即1.8×10⁶ PBMC）。而在對應(yīng)的384孔板格式中，細胞接種密度為每孔1.0×10⁵個；使用1.8×10⁶ PBMC 時，可額外設(shè)置15個孔用于劑量反應(yīng)曲線測試（其中3個孔分配給培養(yǎng)基對照），從而獲取關(guān)于T細胞反應(yīng)親和力的寶貴補充信息。

3.6. 384孔板檢測的信噪比性能較低

現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，在384孔板格式的酶聯(lián)免疫斑點試驗中， PBMC 和試劑每減少三分之一，抗原誘導(dǎo)的斑點計數(shù)（即信號強度）會按比例減少三分之一。由于酶聯(lián)斑點數(shù)據(jù)的解讀依賴于信噪比（培養(yǎng)基背景值），我們比較了兩種板格式的這一指標(biāo)。我們平行測試了三種不同冷凍保存的 PBMC 樣本，這些樣本先前已被確認在兩種孔板格式中分別對 HCMV pp65抗原產(chǎn)生高、中、低反應(yīng)。與先前結(jié)果一致，384孔板中抗原誘導(dǎo)的 SFU 數(shù)量是96孔板中 SFU 數(shù)量的三分之一（圖6）。然而，我們在96孔板和384孔板的中等對照孔中觀察到相似數(shù)量的 SFU ，該數(shù)量在三位供體中介于1至4個斑點之間。96孔板的信噪比平均比384孔板高2.8倍（分別為2.3倍、3.6倍和2.6倍）。在嘗試識別弱T細胞反應(yīng)時，必須考慮384孔板較低的信噪比性能。提高信噪比的一種方法是：對于弱反應(yīng)樣本，從 PBMC 群體中純化CD8細胞并使用純化的CD8細胞而非 PBMC 。CD8細胞可相互呈遞抗原，因此無需額外的非分泌性抗原呈遞細胞（APC）。通常情況下，CD8細胞約占 PBMC 的25%，因此當(dāng)接種細胞數(shù)量相同時，信號強度可提升四倍。此外，由于實驗中不存在旁觀細胞，背景干擾也會降低，從而進一步提高信噪比。

圖6。

96孔板與384孔板的信噪比性能對比。圖中展示了 HCMV pp65抗原誘導(dǎo)反應(yīng)（斜線柱狀圖）及培養(yǎng)基對照（實心柱狀圖——多數(shù)因尺寸過小無法顯示）在三位供體高、中、低反應(yīng)水平下的表現(xiàn)。96孔板 PBMC 數(shù)為3×10⁵，384孔板為1.0×10⁵。各條件下三個重復(fù)孔的平均斑點計數(shù)/孔值標(biāo)注于柱狀圖上方。刺激指數(shù)（SI）定義為抗原誘導(dǎo)的ELISPOT數(shù)除以培養(yǎng)基背景中的斑點數(shù)。對應(yīng)培養(yǎng)基對照/抗原配對的SI值已明確標(biāo)注。

3.7. 384孔板低點計數(shù)的變異系數(shù)高于96孔板對應(yīng)孔位

在酶標(biāo)免疫分析中，稀有抗原特異性T細胞會在大量旁觀細胞中被識別。因此，可以預(yù)期變異系數(shù)（CV：重復(fù)樣本間的孔間變異性）會隨著測試樣本中特異性T細胞數(shù)量的減少而增加。換言之，給定測試樣本中抗原特異性T細胞的頻率越低，該樣本體積在重復(fù)孔中移液時此類細胞的變異性就越高。同樣可以預(yù)測，在相同低濃度抗原特異性細胞條件下，當(dāng)樣本體積較小時，孔間變異性會更高。由于96孔板中接種了100 μL PBMC 樣本，而384孔板中接種了33 μL 相同濃度的 PBMC ，因此384孔板的CV應(yīng)更高。

為驗證這些預(yù)測，我們采用人類 IFN - γ 斑點實驗：用四種抗原刺激三名供體的 PBMC ，同時將 PBMC 按線性范圍連續(xù)稀釋以獲得廣泛的斑點計數(shù)分布。每個細胞樣本和抗原稀釋度均進行四重復(fù)孔實驗。圖7顯示，計算每個復(fù)孔的變異系數(shù)（CV）并繪制其與該復(fù)孔平均斑點數(shù)的關(guān)系曲線。兩種板型中， SFU 較少的孔位CV值均高于 SFU 較多的孔位。96孔板對應(yīng)孔位的CV值低于384孔板。在384孔板格式下檢測低頻抗原特異性T細胞樣本時，這一特性同樣需要納入考量。

圖7。

在檢測低頻T細胞時，384孔板中重復(fù)孔的斑點計數(shù)變異度高于96孔板。對三位供體的 PBMC 進行連續(xù)稀釋檢測，每個供體和細胞稀釋度均設(shè)置四個重復(fù)孔，以評估抗原誘導(dǎo)的 IFN - γ 反應(yīng)。96孔板中 PBMC 以每孔1.0×10⁶至1.0×10⁵個細胞的連續(xù)稀釋度接種，384孔板中則以每孔3×10⁵和3×10⁴個細胞的稀釋度接種。將四個重復(fù)孔的變異系數(shù)（CV）與對應(yīng)檢測結(jié)果的平均斑點數(shù)進行繪圖。

4. 結(jié)論

采用常規(guī)96孔板進行的酶聯(lián)斑點試驗（ELISPOT）相比其他T細胞監(jiān)測技術(shù)，其細胞利用率已顯著提升。通過引入384孔板ELISPOT檢測，我們成功將所需 PBMC 數(shù)量減少三分之二，這與384孔板膜表面積減少三倍的特性相匹配。系統(tǒng)性對比兩種檢測方式發(fā)現(xiàn)：384孔板中抗原誘導(dǎo)的斑點計數(shù)（每孔 PBMC 數(shù)量僅為常規(guī)的三分之一）僅為96孔板的三分之一。因此，384孔板可便捷檢測高頻和中頻抗原特異性T細胞。但針對低頻T細胞，由于鋪板 PBMC 減少，刺激指數(shù)降低和重復(fù)樣本間變異系數(shù)（CV）升高成為必然結(jié)果。在384孔板低頻檢測中，增加重復(fù)孔數(shù)可彌補分辨率不足。由于384孔板重復(fù)孔的ELISPOT計數(shù)服從正態(tài)分布，可采用學(xué)生t檢驗和方差分析等參數(shù)檢驗來識別陽性反應(yīng)。這對弱反應(yīng)尤為重要，因為增加重復(fù)孔數(shù)能以更高統(tǒng)計學(xué)顯著性區(qū)分弱反應(yīng)與陰性反應(yīng)。