染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)的原理及實驗步驟深度揭秘
簡介
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，是表觀遺傳學(xué)研究里的 “明星方法”，能快速鎖定蛋白質(zhì)和 DNA 的結(jié)合位點，揭開二者互作的神秘面紗。
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，是表觀遺傳學(xué)研究里的 “明星方法”，能快速鎖定蛋白質(zhì)和 DNA 的結(jié)合位點，揭開二者互作的神秘面紗。
這項技術(shù)的底層邏輯是抗原抗體的特異性識別：用特定抗體 “釣取” 目標 DNA 結(jié)合蛋白，同時把它結(jié)合的 DNA 片段一起富集起來，最終就能在全基因組層面，搞清楚細胞或組織里蛋白質(zhì)和 DNA 到底是怎么 “互動” 的。
技術(shù)原理
ChIP 技術(shù)的關(guān)鍵在于 “鎖住” 蛋白質(zhì)和 DNA 的真實結(jié)合狀態(tài)：先在細胞正常生長的條件下，用化學(xué)試劑把 DNA 和結(jié)合在上面的蛋白質(zhì) “粘” 在一起，避免后續(xù)操作中二者分離；接著用超聲或酶把纏結(jié)的染色質(zhì)剪成小段，方便后續(xù)精準篩選；再用專門識別目的蛋白的抗體，把 “蛋白 - DNA” 復(fù)合物 “抓” 出來，實現(xiàn)特異性富集。
整個實驗要經(jīng)過細胞固定、染色質(zhì)剪碎、免疫沉淀、解除交聯(lián)、DNA 提純、DNA 檢測這幾步。不過因為步驟多、每一步的操作細節(jié)都容易影響結(jié)果，所以做實驗時一定要設(shè)置對照，而且得結(jié)合經(jīng)驗判斷結(jié)果是否可靠，這樣才能避免實驗白做。
研究意義
實驗材料
一、核心器材
二、試劑與耗材
核酸與蛋白質(zhì)作為生命活動的核心生物大分子，二者之間的動態(tài)相互作用是調(diào)控各類生命進程的基礎(chǔ)，貫穿細胞生長、增殖、分化、遺傳信息傳遞及代謝穩(wěn)態(tài)維持等關(guān)鍵生理過程。深入解析蛋白質(zhì)與核酸的互作機制，是揭開生命現(xiàn)象本質(zhì)、闡明疾病發(fā)生發(fā)展分子機理的核心突破口。而染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，憑借其能在生理狀態(tài)下捕獲蛋白質(zhì)與DNA天然結(jié)合狀態(tài)的優(yōu)勢，成為表觀遺傳學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域中，研究蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系、挖掘基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心工具，為疾病機制研究、藥物靶點篩選等提供了重要技術(shù)支撐。
一、核心器材
靜音混合器、高速低溫離心機、超聲破碎儀、電泳儀、水平電泳槽、普通PCR儀、實時熒光定量PCR儀（Real-time PCR儀）。
1. 細胞樣本：HeLa細胞；
2. 緩沖液及基礎(chǔ)試劑：HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaHCO₃、去氧膽酸鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris緩沖液、蛋白酶抑制劑混合物、蛋白酶K；
3. 免疫沉淀相關(guān)試劑：Protein A/G磁珠（預(yù)結(jié)合鮭精DNA封閉）；
4. 對照及檢測試劑：GAPDH對照引物、陽性對照抗體（乙酰化組蛋白H3抗體，Anti-Acetyl Histone H3）、陰性對照抗體（正常家兔IgG，Normal IgG）；
5. 核酸檢測試劑：瓊脂糖、PCR反應(yīng)Mix、SYBR Green qPCR Mix。
三、實驗步驟
（二）細胞固定
ChIP實驗核心流程可分為試劑配制、細胞固定、染色質(zhì)斷裂、免疫沉淀等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中試劑配制與細胞固定是保障實驗成功的基礎(chǔ)，具體操作如下：
（一）試劑配制
所有緩沖液需提前配制并調(diào)節(jié)至對應(yīng)pH值，蛋白酶抑制劑需臨用前新鮮加入，避免酶解目標蛋白，具體配方如下：
（1）裂解緩沖液（FA Lysis Buffer）：50 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.5）、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1％ Triton X-100、0.1％ 去氧膽酸鈉、0.1％ SDS，臨用前加入適量蛋白酶抑制劑。
（2）RIPA緩沖液：50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1% NP-40、0.5％ 去氧膽酸鈉、0.1％ SDS，臨用前加入適量蛋白酶抑制劑。
（3）漂洗緩沖液（Wash Buffer）：0.1％ SDS、1％ Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
（4）最終漂洗緩沖液（Final Wash Buffer）：0.1％ SDS、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
細胞固定的核心是在生理狀態(tài)下交聯(lián)DNA與蛋白質(zhì)，維持二者天然結(jié)合狀態(tài)，操作需輕柔以避免細胞破裂，步驟如下：
（1）取直徑150 mm培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)的HeLa細胞匯合度達80%~90%（細胞數(shù)量約1×10⁷個）時進行實驗；向培養(yǎng)皿中20 ml培養(yǎng)基內(nèi)，加入550 μl 37%甲醛（或1100 μl 18.5%甲醛），使甲醛終濃度為1%。
（2）輕柔晃動培養(yǎng)皿混勻，室溫孵育10 min，確保交聯(lián)充分且均勻。
（3）終止交聯(lián)：加入甘氨酸至終濃度125 mmol／L，輕柔混勻后室溫孵育5 min，徹底終止甲醛的交聯(lián)作用。
（4）將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷，抑制細胞內(nèi)源性酶活性，防止目標復(fù)合物降解。
（5）小心吸盡培養(yǎng)基，加入20 ml冰冷的PBS，輕柔清洗細胞表面殘留培養(yǎng)基及試劑。
（6）吸盡PBS，重復(fù)上述PBS清洗步驟1次，確保清洗徹底。
（7）加入2 ml含1×蛋白酶抑制劑復(fù)合物的冰冷PBS，用細胞刮刀沿培養(yǎng)皿壁輕柔刮取細胞，收集至1.5 ml離心管中。
（8）置于高速低溫離心機，1000 g、4 ℃條件下離心5 min，收集細胞沉淀。
（9）吸棄上清液，向細胞沉淀中加入750 μl預(yù)冷的FA Lysis緩沖液，輕柔吹打重懸細胞，獲得細胞裂解液，后續(xù)用于染色質(zhì)斷裂步驟。
（三）染色質(zhì)斷裂
（四）染色質(zhì)免疫沉淀
（五）解交聯(lián)反應(yīng)和DNA的純化
（六）DNA的鑒定
（七）實驗結(jié)果及分析
注意事項
（1）將含細胞裂解液的離心管置于冰上，進行超聲破碎。超聲參數(shù)設(shè)定為：功率310 W，沖擊20 s，間隔2 s，共進行3個循環(huán)。需注意，超聲條件具有細胞系特異性，且與細胞數(shù)量密切相關(guān)，需通過預(yù)實驗摸索確定最優(yōu)條件。超聲過程中，將探頭盡量深入管內(nèi)，但避免接觸管底及側(cè)壁，防止產(chǎn)生泡沫影響實驗效果。
（2）超聲破碎完成后，于4 ℃、10,000 g條件下離心10 min，去除細胞碎片等不溶性雜質(zhì)。
（3）小心吸取上清液，分裝至新的1.5 ml離心管中，每管50 μl，分裝后可置于-80 ℃冰箱保存，保存期最長不超過3個月。
（4）取100 μl超聲破碎產(chǎn)物，加入5 μl濃度為20 mg/ml的蛋白酶K，于65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)混勻，進行解交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時長為4~5 h（或過夜）。反應(yīng)結(jié)束后，取一半樣品進行酚-氯仿抽提，后續(xù)通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測超聲破碎效果，確保染色質(zhì)片段符合實驗要求。
（1）將每管50 μl的超聲破碎產(chǎn)物按1:10比例稀釋，加入450 μl RIPA緩沖液，輕輕混勻。從中吸取5 μl（占總體積的1%）作為Input對照，置于4 ℃保存，備用（用于后續(xù)第4步驗證）。
（2）向每個樣品管中分別加入陽性對照抗體、陰性對照抗體（正常IgG）及目標蛋白抗體，抗體用量范圍為1~10 μg。由于抗體的效力、純度及特異性存在差異，建議通過抗體梯度稀釋實驗，確定該實驗體系的最適抗體用量。
（3）向各管中加入20 μl充分混勻的Protein A／G beads（預(yù)結(jié)合鮭魚精DNA，Salmon Sperm DNA），輕柔混勻。
（4）置于4 ℃環(huán)境中旋轉(zhuǎn)孵育1 h（或過夜），確�？贵w與抗原及beads充分結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
（5）孵育結(jié)束后，于2000 g條件下離心1 min，小心棄去上清液，保留beads復(fù)合物。
（6）用1 ml Wash緩沖液清洗beads，共清洗3次，每次清洗后于2000 g離心1 min，棄去上清液，徹底去除未結(jié)合的雜蛋白及雜質(zhì)。
（7）最后用1 ml Final Wash緩沖液清洗beads 1次，2000 g離心1 min，棄去上清液，完成beads純化。
通過蛋白酶K介導(dǎo)的解交聯(lián)反應(yīng)釋放結(jié)合的DNA，隨后采用酚-氯仿抽提結(jié)合乙醇沉淀法純化DNA，或直接使用DNA純化柱回收DNA，具體步驟如下：
（1）向每份樣品（含Input對照組）中加入120 μl Elution緩沖液，置于30 ℃環(huán)境中旋轉(zhuǎn)孵育15 min，使DNA從免疫復(fù)合物中洗脫。
（2）于2000 g條件下離心1 min，收集上清液。
（3）將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可暫時置于-20 ℃保存。
（4）向各管中加入5 μl濃度為20 mg/ml的蛋白酶K，65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)混勻，進行二次解交聯(lián)反應(yīng)，時長4~5 h（或過夜），確保交聯(lián)完全解除。
（5）對解交聯(lián)后的樣品進行酚-氯仿抽提，后續(xù)通過乙醇沉淀法純化DNA，純化后加入100 μl無菌水溶解DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
ChIP實驗回收DNA的常用鑒定方法為半定量PCR和實時熒光定量PCR（Real-time PCR），可通過擴增特異性靶序列驗證實驗有效性及富集效率。
（1）交聯(lián)后的染色質(zhì)經(jīng)超聲斷裂后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分析，合格的破碎效果應(yīng)滿足：染色質(zhì)片段平均長度在200~1000 bp之間，片段分布均勻，無明顯拖尾或大片段殘留。
（2）對純化后的DNA片段進行PCR擴增驗證，選取管家基因GAPDH的啟動子區(qū)作為擴增靶序列（擴增片段大小為165 bp）。理想結(jié)果為：陽性對照及Input對照均能檢測到清晰的擴增條帶，無DNA模板的空白對照無擴增條帶，陰性對照（正常IgG）可出現(xiàn)微弱擴增條帶，但條帶亮度與陽性對照存在顯著差異，表明實驗特異性良好。
（1）甲醛交聯(lián)時間需通過預(yù)實驗確定，因其受細胞類型、細胞數(shù)量影響較大。交聯(lián)時間過長會導(dǎo)致實驗材料丟失，且增加超聲破碎難度；交聯(lián)時間過短則會造成交聯(lián)不完全，影響免疫沉淀效果。
（2）超聲破碎通過機械力斷裂染色質(zhì)，過程中易產(chǎn)生熱量及泡沫，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低ChIP效率。因此，超聲操作需全程在冰上進行，采用時斷時續(xù)的超聲程序，避免長時間連續(xù)超聲，防止蛋白質(zhì)降解及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞。
（3）ChIP實驗需設(shè)置完善的對照體系，缺少對照會無法評估實驗結(jié)果的可靠性。陽性抗體對照、陰性抗體（正常IgG）對照為基礎(chǔ)對照；Input對照不僅可驗證染色質(zhì)破碎效果，還能根據(jù)Input及沉淀樣品中靶序列的含量，按取樣比例計算ChIP富集效率，是實驗有效性驗證的關(guān)鍵。
（4）目標蛋白抗體的選擇是ChIP實驗成功的核心。蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)后，抗體的抗原表位可能被掩蓋（與染色質(zhì)結(jié)合位點過近），導(dǎo)致抗體無法識別，影響免疫復(fù)合物形成。因此，并非所有抗體均適用于ChIP實驗，需選用經(jīng)ChIP實驗驗證合格的抗體，以保障實驗結(jié)果的準確性和可靠性。
樂備實（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學(xué)分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴展到單細胞測序、空間多組學(xué)、流式檢測、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
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