Bulk RNA-seq與單細胞轉錄組測序整合應用的方案設計及案例分享
Bulk RNA-seq與單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）的整合應用，已成為當前生命科學領域解析復雜生物學問題的核心研究策略。Bulk RNA-seq聚焦組織或細胞群體的整體表達水平，具備測序深度深、基因覆蓋度廣、數據穩(wěn)定性高的優(yōu)勢，可高效獲取樣本全局轉錄組特征；scRNA-seq則突破群體平均表達的局限，以單細胞分辨率精準解析細胞異質性，清晰界定不同細胞亞群的轉錄組差異及功能特性。二者的協同聯用可實現技術優(yōu)勢互補：Bulk RNA-seq為研究提供宏觀轉錄組背景框架與核心表達趨勢，scRNA-seq則完成目標基因或通路的細胞類型級精準定位，不僅能通過交叉驗證提升實驗結果的可靠性與重復性，更可從“群體-單細胞”雙維度層層遞進，深化對生物學過程調控機制的系統(tǒng)認知，為后續(xù)功能驗證及轉化研究筑牢數據根基。
一、基于scRNA-seq挖掘的細胞類型特異性表達模式，通過Bulk RNA-seq進行群體水平驗證
scRNA-seq實驗設計：嚴格設置3個及以上生物學重復，規(guī)避個體差異及技術偏差對細胞亞群注釋、特異性基因篩選的干擾，精準識別不同細胞類型的特征性表達譜及核心調控基因。
Bulk RNA-seq實驗設計：選取與scRNA-seq來源一致的組織樣本或細胞群體，保持實驗分組、處理條件的一致性，同步設置3個及以上生物學重復，通過群體水平測序驗證scRNA-seq所獲細胞類型特異性基因的表達趨勢，強化結果的統(tǒng)計學意義與普適性。
scRNA-seq實驗設計：設置3個及以上生物學重復，確保細胞亞群分群的準確性與穩(wěn)定性，為差異基因的細胞定位提供高分辨率數據支撐。
Bulk RNA-seq實驗設計：可先通過流式細胞術分選目標細胞亞群，或直接采用全組織樣本進行測序，篩選不同處理組間的差異表達基因（DEGs）；實驗需設置3個及以上生物學重復，保障差異基因篩選的可靠性，為后續(xù)scRNA-seq精準定位其表達的細胞亞群提供明確靶向。
💯核心分析
💯文獻案例
一：ATM缺失誘導小膠質細胞激活促進共濟失調毛細血管擴張癥的神經退行性病變
A-T患者iPSC衍生的小膠質細胞在神經元共培養(yǎng)中表現出細胞內激活和細胞毒性增強
標題：ATM-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia
期刊：Cell Reports
影響因子：6.9
研究背景：
共濟失調-毛細血管擴張癥（ataxia-telangiectasia, A-T）是一種由ATM基因突變所致的罕見遺傳性疾病，其核心病理特征為選擇性小腦神經元進行性退化，臨床表現復雜且預后較差，目前其潛在發(fā)病機制尚未完全闡明。ATM蛋白作為多功能調控分子，除核心介導DNA損傷應答通路外，還廣泛參與細胞代謝穩(wěn)態(tài)調控、溶酶體功能維持等多種生理過程。值得注意的是，ATM缺失小鼠模型難以復現人類A-T特有的小腦退化表型，而人類細胞層面的研究提示，鈣信號通路（如ITPR1介導的信號傳導）紊亂、突觸功能異常及氧化應激失衡等可能參與疾病發(fā)生。近年來，新興研究證據表明小膠質細胞吞噬功能障礙或與A-T病理進程密切相關，但其在ATM缺失介導的神經退行性病變中的具體作用機制及調控網絡，仍是當前領域亟待明確的關鍵科學問題，也為該研究的開展提供了核心切入點。
研究思路：
研究結果：
本研究創(chuàng)新性整合單核RNA測序（snRNA-seq）與Bulk轉錄組分析技術，系統(tǒng)解析了ATM缺陷介導共濟失調毛細血管擴張癥（A-T）小腦退化的細胞特異性機制。此前基于Bulk轉錄組的研究雖已揭示A-T患者腦組織整體基因表達譜的紊亂特征，但受限于群體平均表達水平的檢測模式，無法精準區(qū)分不同細胞類型的特異性轉錄組變化，難以闡明病變的細胞起源。為此，本研究通過snRNA-seq技術構建了人類小腦及前額葉皮層的高分辨率單細胞轉錄組圖譜，成功注釋出浦肯野細胞、顆粒細胞及小膠質細胞等中樞神經系統(tǒng)核心細胞類型。
A-T患者iPSC衍生的小膠質細胞在神經元共培養(yǎng)中表現出細胞內激活和細胞毒性增強二：E3 泛素連接酶 Rbx1 介導胸腺發(fā)育調控及 αβ/γδ T 細胞命運抉擇
標題：E3 Ligase Rbx1 Orchestrates Thymus Development and Fate Determination of αβ-γδ T Cells
期刊：Research
標題：E3 Ligase Rbx1 Orchestrates Thymus Development and Fate Determination of αβ-γδ T Cells
期刊：Research
影響因子：16.6
研究背景：
胸腺是 T 細胞分化的核心場所，骨髓來源的前體細胞在此分化為 αβ 與 γδ 兩大亞型，DN3 階段為二者的命運分叉關鍵節(jié)點：αβ T 細胞進一步發(fā)育為 CD4⁺/CD8⁺亞群，參與機體適應性免疫應答；γδ T 細胞則作為先天免疫效應細胞，可分化為 IFN-γ⁺（γδ T1）或 IL-17⁺（γδ T17）亞群，在抗感染與抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。目前，調控 αβ/γδ T 細胞分化的分子機制仍未闡明。Neddylation-CRL 系統(tǒng)是最大的 E3 泛素連接酶家族，其通過 Rbx1/Sag 等 E3 酶及 Ube2m/Ube2f 等 E2 酶介導底物泛素化降解，雖已被證實參與 Treg、樹突狀細胞等免疫細胞的功能調控，但其在胸腺發(fā)育及 αβ/γδ T 細胞命運決定中的作用，至今仍是研究空白。
研究思路：
研究結果：
本研究構建胸腺特異性敲除 Ube2m、Ube2f、Rbx1 或 Sag 的條件性基因敲除小鼠模型，結果證實僅 Rbx1 對胸腺發(fā)育及 αβ/γδ T 細胞命運決定具有關鍵調控作用。Rbx1 缺失可引發(fā)胸腺萎縮、T 細胞發(fā)育阻滯，伴隨胸腺內 γδ T 細胞占比顯著升高、未成熟 Gzma⁺ γδ T 細胞比例擴增，且增殖亞群占比降低；上述部分表型可通過共敲除 Bim 實現部分逆轉。機制研究表明，Rbx1 缺失會重塑祖 γδ T 細胞 / DN3a 細胞中 Akt、NF-κB 及代謝通路的活性；最終，Rbx1 缺失可顯著改變胸腺內 γδ T1/T17 細胞亞群的構成，明確揭示 Rbx1 對 γδ T 細胞命運決定的調控功能。
Rbx1對DN3和DN4細胞功能的單細胞轉錄組測序研究
胸腺中Rbx1缺陷型DN3a細胞的轉錄分析
三：衰老免疫細胞釋放顆粒鈣素促進骨骼衰老
標題：Senescent immune cells release grancalcin to promote skeletal aging
期刊：Cell Metabolism
期刊：Cell Metabolism
影響因子：30.9
研究背景：
骨髓微環(huán)境通過提供信號支持并調控各類骨相關細胞功能，維持骨穩(wěn)態(tài)平衡。骨穩(wěn)態(tài)的維持依賴骨髓內細胞活動的協同調控，其中成骨細胞介導的骨形成是核心環(huán)節(jié)之一。然而，衰老過程中骨穩(wěn)態(tài)常被打破，表現為骨轉換水平降低、骨髓脂肪異常積聚，最終誘發(fā)骨質疏松及脆性骨折，其潛在機制尚未完全闡明。已有研究證實，免疫細胞隨衰老在骨髓中富集，可能通過分泌特異性因子參與骨衰老進程；顆粒鈣素（GCA）作為五 EF 手鈣結合蛋白家族成員，雖已知參與免疫調節(jié)，但在骨衰老中的具體功能及調控通路仍不明確�；诖耍狙芯恐荚谙到y(tǒng)探究 GCA 作為衰老免疫細胞分泌因子，通過受體 PLXNB2 介導的信號通路抑制骨形成、促進脂肪生成的分子機制，為揭示骨衰老新機制及開發(fā)針對性干預策略提供潛在靶點。
研究思路：
研究結果：
本研究發(fā)現，大鼠與小鼠衰老進程中，促炎及衰老表型的免疫細胞亞型（含巨噬細胞、中性粒細胞）在骨髓中富集，并大量分泌顆粒鈣素（GCA）。向幼鼠注射重組 GCA（rGCA）可直接誘導骨骼早衰；反之，特異性敲除中性粒細胞與巨噬細胞中的 GCA 基因，能顯著延緩骨骼衰老進程。機制層面，GCA 可與 plexin-B2 受體結合，通過部分抑制其下游信號通路，調控骨髓間充質干細胞功能，最終抑制成骨分化、促進脂肪生成。進一步研究顯示，骨骼干細胞中 Plexnb2 雜合子缺失，可顯著改善 GCA 基因敲除小鼠的骨表型。此外，作者研發(fā)的 GCA 中和抗體，對老年小鼠進行治療后可有效改善其骨骼健康。綜上，本研究證實 GCA 是調控骨骼衰老的關鍵因子，有望成為老年性骨質疏松癥的潛在治療靶點。
促炎和衰老免疫細胞在骨髓中積累，并在衰老過程中分泌豐富的GCA
GCA抑制成骨和破骨細胞生成，同時促進脂肪生成
💯總結：
scRNA-seq 與 Bulk RNA-seq 的整合分析，突破了單一測序技術的局限 —— 以 Bulk RNA-seq 構建的宏觀表達背景為基礎，結合 scRNA-seq 解析的細胞類型特異性及異質性信息，形成 “宏觀 - 微觀” 相互驗證、補充的分析體系，既提升了研究結論的穩(wěn)健性，又推動生物學機制研究從群體平均表型深入至單細胞異質性層面。目前，該策略已廣泛應用于復雜生物學過程解析、疾病發(fā)生發(fā)展機制探索等領域，成為不可或缺的核心研究工具。展望未來，隨著空間轉錄組、蛋白質組、代謝組等多組學技術的發(fā)展，將其與 scRNA-seq/Bulk RNA-seq 整合策略相結合，有望進一步揭示細胞功能的時空動態(tài)調控網絡，實現對生命活動本質更系統(tǒng)、深入的認知。
💯scRNA-seq 與 Bulk RNA-seq測序哪個公司提供：
樂備實提供單細胞轉錄組測序（點擊）和Bulk RNA-seq測序（點擊）。
樂備實（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國內專注于提供高質量蛋白檢測以及組學分析服務的實驗服務專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務技術平臺已擴展到單細胞測序、空間多組學、流式檢測、超敏電化學發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
