H1(hESC/iPSC)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)攻略及步驟

一、復(fù)蘇要點(diǎn)

1、hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制

表 1：hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒

表 2：hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配置說明

1）4°C下解凍A過夜，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。A凍融總次數(shù)不能超過2次，按5mL每管分裝。
2）4°C下解凍C過夜，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。C凍融總次數(shù)不能超過2次，按100ul每管分裝。Y27632只在復(fù)蘇、傳代的第一天使用，凍存使用。
3）參考表1，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，4°C儲(chǔ)存，2周內(nèi)用完。完全培養(yǎng)基可分裝-20 °C 下儲(chǔ)存長達(dá) 6 個(gè)月。
4）使用前，完全培養(yǎng)基在室溫下預(yù)熱至不再感覺冰涼。

2、基質(zhì)膠鋪板（以包被6孔板為例）

基質(zhì)膠(IPS驗(yàn)證無酚紅 abs9496 1.5mL×4 10mg/ml Store at -80℃ for 2年)

1）將基質(zhì)膠于4°C冰箱里的冰浴中過夜解凍。200ul、1mL槍頭提前-20℃過夜預(yù)冷。
2）用4°C預(yù)冷的DMEM/F12將基質(zhì)膠原液以1:100的比例進(jìn)行稀釋。例如：將1.5mL基質(zhì)膠加入已含有150mLDMEM/F12的離心管中，包被量為300uL/cm²，6孔板每孔10cm²，每孔3mL，均勻鋪開并完全覆蓋培養(yǎng)板。剩余包被液4℃兩周內(nèi)用完。
3）將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱預(yù)熱。
4）將含有包被液的培養(yǎng)板在室溫靜置一小時(shí)。注意一定不要讓包被過的培養(yǎng)板表面變干。
5）吸掉包被液，并在培養(yǎng)板上立即種上干細(xì)胞與培養(yǎng)基混合液。

3、復(fù)蘇 hESC/iPSC（以6孔板為例）
1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫（15~30℃）。
2）取3 mL hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入6μL Supplement C終濃度為10uM，取9 mL含有Supplement C DMEM/F12，加入18 μL Supplement C使終濃度為10uM，恢復(fù)至室溫（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。
3）取出1支冷凍的細(xì)胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時(shí)取出（冰晶剩綠豆大小時(shí)）。
4）75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL 含Y27的DMEM/F12，過程中輕柔晃動(dòng)混勻細(xì)胞，160g離心5 min。
5）吸棄六孔板內(nèi)的鋪板液，將2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基靠壁緩慢加入六孔板孔中。
6）離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細(xì)胞混勻在上清中，逐滴緩慢加入 1mL 含有 Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，輕彈管底 3-4 下 混勻細(xì)胞，將這 1mL 細(xì)胞懸空滴加進(jìn) 6 孔板的含有 Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中。
7）水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO₂濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。注：水平十字搖勻3次，左右兩次+上下兩次算一次
8）18-24小時(shí)后換新的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基（6孔板，2mL/孔）。注：在hiPSC培養(yǎng)過程中，如果細(xì)胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

二、傳代要點(diǎn)

1、條件和比例

圖1. hESC/iPSC完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hiPSC細(xì)胞形態(tài)圖：（A）和（B）分別為hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)第2和4天時(shí)低倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖示，（C）和（D）為培養(yǎng)至第2和4天時(shí)的高倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖。

（1）傳代條件：
細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右（如圖1(C-D)所示），一般情況下每3-4天傳代；
細(xì)胞匯合度較高，集落變得過于密集或過大；
細(xì)胞集落分化增多。
注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

（2）傳代比例：
可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代。
如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度85%，大小均勻（如圖1(B-D)所示），建議按照1:10進(jìn)行傳代；
如果密度偏低，則可降低傳代比例；
密度偏高，則增加傳代比例。
注：1:10傳代就是1個(gè)孔傳10個(gè)孔（以6孔板為例）。

2、消化

圖2：消化hiPSC細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)圖：（A）消化5 min高倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化6 min高倍鏡hiPSC培養(yǎng)的形態(tài)圖。

1）將 Matrigel 包被的6孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫（~25℃）。
2）根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔+1mL的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度為10uM，恢復(fù)至室溫（~25℃）。
3）將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入1 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸棄。
4）加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。
5）置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5-6 min。

注：
① 消化5-6 min后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時(shí)間；hiPSC細(xì)胞不能長時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution（＜10min）。
② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

6）消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
及時(shí)吸取2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ Supplement C，快速輕柔吹打，利用槍頭中的培養(yǎng)基吹打一次后，吸懸液再吹打一次，使細(xì)胞脫離基質(zhì)。

注：
① 加hESC/iPSC完全培養(yǎng)基 + Supplement C時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正常現(xiàn)象，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時(shí)間（< 10min）。
② hiPSC細(xì)胞不能長時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速，以及最好一次操作不要超過4孔（六孔板）。

7）吸棄6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ Supplement C 2 mL/孔。
8）在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。
9）接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO₂濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。
10）18-24小時(shí)后更換新hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。

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