技術(shù)案例解析：iPSC建庫(kù)后基因突變的解決方案

Cellected 是一家提供針對(duì) iPSC 相關(guān)技術(shù)服務(wù)的公司，現(xiàn)有技術(shù)路線包括 RIQUEST（用于質(zhì)量控制）、RESCUE 和 SEED & GO 服務(wù)。幫助客戶快速、高效地符合 ISSCR（國(guó)際干細(xì)胞研究協(xié)會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于過(guò)程質(zhì)量控制的要求，幫助挽救出現(xiàn)基因/基因組異常的細(xì)胞株，降低 iPSC 分析中的變異性和成本。

本次講座由 Cellected 的 CEO-Clarie Rechard 博士與大家分享如何使用 VIPS 單細(xì)胞鋪板儀以及 CMX 單克隆成像儀優(yōu)化 iPSC 培養(yǎng)條件及大規(guī)模篩選單克隆的技術(shù)路線，通過(guò) CMX 追蹤克隆團(tuán)生長(zhǎng)，快速獲取克隆篩選參數(shù)如匯合度數(shù)值，加速篩選流程。

--講座內(nèi)容摘要--

iPSC（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞），因其應(yīng)用的廣泛性例如：通用型細(xì)胞治療藥物、疾病模型、毒性檢測(cè)甚至細(xì)胞肉生產(chǎn)，而備受關(guān)注。那么無(wú)論何種應(yīng)用，我們都需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制（QC）來(lái)確保高質(zhì)量的細(xì)胞生產(chǎn)。

iPSC 培養(yǎng)過(guò)程有很多挑戰(zhàn)，例如：

• 不同細(xì)胞株差異大，我們需要調(diào)整培養(yǎng)基與基質(zhì)膠的組合達(dá)到培養(yǎng)的最優(yōu)條件；
• 此外，不同批次的培養(yǎng)試劑可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果差異，導(dǎo)致面臨一致性差異的挑戰(zhàn)，從而增加物料及時(shí)間成本。

所以我們應(yīng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)流程進(jìn)行規(guī)律性的 QC，那么何時(shí)做，如何做，并非容易確定。良好且高效的 QC 可以降低成本、提高效率、保證產(chǎn)品的可持續(xù)性。ISSCR 提供了一些很有幫助的指導(dǎo)原則和建議。對(duì)于 iPSC QC 及特性分析，我們主要關(guān)注以下三點(diǎn)：

01. 基本因素（包含細(xì)胞是否污染、STR 類型，生長(zhǎng)、形態(tài)等）；

02. 功能性驗(yàn)證（基因表達(dá)分析、分化潛能）；

03. 基因組穩(wěn)定性（CNV/SNV 分析、基因編輯正確性/有無(wú)脫靶等）。

何時(shí)進(jìn)行 QC 檢測(cè)因項(xiàng)目不同而不同，我們一般在以下情況進(jìn)行 QC 檢測(cè)，例如在重要項(xiàng)目開(kāi)始前，在 iPSC 經(jīng)過(guò)編輯或者凍存后以及在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，突然出現(xiàn)表型改變或者實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等階段。

研究證明 iPSC 細(xì)胞株有 20%-30% 的基因突變概率，例如早期證明的 20q11.21 位點(diǎn)的 CNVs，以及最近發(fā)現(xiàn)的 TP53、BCOR 的基因突變 ，這些突變隨傳代次數(shù)增加而增加，并對(duì)項(xiàng)目產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株存在基因突變，能做的改變幾乎沒(méi)有，只能丟棄。那么如何挽救混有突變株的單克隆庫(kù)？我們需要做亞克隆，并且篩選樣本量會(huì)非常大，因?yàn)槲覀儾恢�道未突變的�?xì)胞群體所占比例。那么，從單克隆篩選手段來(lái)講，手動(dòng)鋪板幾乎不可能，所以我們需要一個(gè)高效的鋪板方式，并且有較高的克隆恢復(fù)率。我們使用 Solentim 的 VIPS 單細(xì)胞鋪板儀結(jié)合 CMX 單克隆成像儀進(jìn)行單克隆篩選，克隆生長(zhǎng)追蹤，并進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，使克隆恢復(fù)率達(dá)到最高 70%。最終我們選取單克隆來(lái)源且克隆形態(tài)符合要求（通過(guò) CMX 成像判斷）的克隆團(tuán)進(jìn)行基因分析，排除突變細(xì)胞株。我們的技術(shù)路線能夠最大程度減少各類成本。

關(guān)于具體的技術(shù)路線歡迎觀看視頻，提綱：

01. 使用 VIPS 單細(xì)胞鋪板儀及 CMX 單克隆成像儀進(jìn)行培養(yǎng)試劑優(yōu)化來(lái)提高單克隆恢復(fù)率；

02. 通過(guò) VIPS 單細(xì)胞鋪板儀及 CMX 單克隆成像儀確認(rèn)單克隆來(lái)源性及克隆形態(tài)來(lái)篩選目的克隆株用于質(zhì)量檢測(cè)；

03. 基因組突變篩查。