SHASHIN KAGAKU自動菌落計數儀在大腸菌群平板計數法中的應用

方案摘要：本方案基于大腸菌群計數標準原理，整合 Pipetty 電動移液器與自動菌落計數儀的核心優(yōu)勢，優(yōu)化實驗全流程。樣品稀釋環(huán)節(jié)，借助 Pipetty 的精準定量與連續(xù)稀釋功能，高效制備 10 倍遞增系列稀釋液，避免手動操作誤差；接種時通過其定量接種功能，確保每皿 1mL 接種量精準一致。培養(yǎng)后采用自動菌落計數儀，預設菌落識別參數，快速篩選有效平板、區(qū)分典型與可疑菌落，計數效率較人工大幅提升提升，且支持數據與圖像存儲追溯。確認試驗中，依托儀器菌落定位功能精準挑取目標菌落驗證。方案大幅提升實驗精準性、效率性與規(guī)范性，縮短驗周期，適用于各類樣品的大腸菌群檢測，保障數據可靠可追溯。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       以 VRBA 培養(yǎng)基為核心，利用膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌，僅允許大腸菌群等革蘭氏陰性菌生長。大腸菌群發(fā)酵培養(yǎng)基中乳糖產酸，使中性紅指示劑變紅，形成紅色至紫紅色典型菌落（部分帶沉淀環(huán)），實現特異性識別。通過10倍遞增稀釋樣品，讓平板菌落數落在 15-150 CFU 的可計數范圍，再挑取典型/可疑菌落接種 BGLB 肉湯，觀察發(fā)酵產氣情況排除假陽性，最終定量樣品中大腸菌群數量。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 冰箱:2 ℃~8 ℃；
③ 恒溫裝置:48 ℃±2℃；
④ 天平:感量 0.1 g；
⑤ 均質器及無菌均質袋、均質杯,振蕩器；
⑥ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm ；
⑦ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃；
⑧ 無菌錐形瓶:容量 500 mL；
⑨ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm；
⑩ pH 計或精密 pH 試紙；
⑪ 無菌接種環(huán):10μL(直徑約3mm)；
⑫ SHASHIN KAGAKU自動菌落計數儀。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、實驗步驟
1、稀釋樣品
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min~10000 r/min 均質1 min~2 min。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中充分混勻。
③ 必要時用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1調節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5之間。
④ 使用 Pipetty 電動移液器，裝配無菌吸頭，吸取1:10樣品勻液 1mL，沿無菌試管管壁緩緩注入預裝有9mL緩沖液/生理鹽水的無菌試管中（吸頭尖端不觸及稀釋液面）。試管置于振蕩器上振蕩混勻，制成1:100勻液；按樣品污染狀況估計，重復上述操作，依次制備10倍遞增系列稀釋液，每遞增稀釋1次，更換1個無菌吸頭。
 
2、根據樣品污染狀況估計，選取2-3個連續(xù)適宜稀釋度（液體樣品可含原液），每個稀釋度設置2個無菌培養(yǎng)皿。使用 Pipetty 電動移液器更換新無菌吸頭，精準吸取1mL對應稀釋度的樣品勻液，垂直注入培養(yǎng)皿中央，同時設2個空白對照，每皿注入1mL緩沖液/生理鹽水。
3、盡快向培養(yǎng)皿倒入 48℃±2℃的VRBA培養(yǎng)基，每皿15-20mL，輕輕旋轉培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻，水平靜置待其凝固。凝固后，均勻覆蓋3-4mL VRBA至平板表面，覆層凝固后翻轉平板。
4、將平板放入自動菌落計數儀內，預設顏色閾值：紅色-紫紅色直徑閾值：0.5mm，自動掃描平板。儀器自動計測菌落數量，并精確轉換成CFU，篩選菌落數在15-150 CFU 之間的有效平板，同時區(qū)分典型菌落（紅色至紫紅色、直徑≥0.5mm、周圍帶紅色沉淀環(huán)）與可疑菌落（紅色至紫紅色、直徑≤0.5mm），分別統(tǒng)計數量并生成計數報告。
 
5、確認試驗
① 基于自動菌落計數儀的計數結果，精準挑取目標菌落進行驗證，確保大腸菌群陽性結果的準確性。
② 從同一稀釋度的 VRBA 平板上，精準挑取典型和可疑菌落各 5 個；若典型或可疑菌落少于 5 個，則挑取全部菌落。
③ 每個挑取的菌落接種1支BGLB肉湯管，置于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。
④ 培養(yǎng) 24h±2h 后，觀察并記錄產氣情況，產氣者為大腸菌群陽性；未產氣者繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，若產氣仍判定為陽性，未產氣則為陰性。
 
四、結果報告
1、所選稀釋度的典型菌落數以及可疑菌落數與各自大腸菌群陽性率的乘積之和的平均值,乘以稀釋倍數,為大腸菌群的菌落數。大腸菌群的菌落數小于 100 CFU時,按“四舍五入”的原則修約,以整數報告。大腸菌群的菌落數大于或等于 100 CFU時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數；也可用 10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數字。若空白對照上有菌落生長,則此次檢驗結果無效。
2、稱重取樣以 CFU/g為單位報告結果,體積取樣以 CFU/mL,為單位報告結果。