RNA干擾技術(shù)介導(dǎo)基因沉默的原理及其應(yīng)用場(chǎng)景和臨床應(yīng)用
相信很多同學(xué)和老師們都會(huì)在科研中涉及基因沉默，如何選擇合適的基因沉默方法往往會(huì)讓人頭疼不已，今天就給大家介紹一下如何選擇合適的 RNA 干擾技術(shù)來進(jìn)行基因沉默。
Section.01
RNA 干擾技術(shù)
RNA 干擾是一種通過 RNA 分子介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制，相較于常規(guī)的抑制劑，RNA 干擾技術(shù)具有無靶點(diǎn)限制、特異性強(qiáng)、生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)。常見的應(yīng)用于 RNA 干擾的寡核苷酸有小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 等 (圖 1) ，其基本原理是利用 siRNA、miRNA 或 ASO 與特定的目標(biāo)基因 mRNA 序列相互作用，從而誘導(dǎo)靶基因的降解或抑制其翻譯，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的沉默或抑制。
圖 1. 常見的 RNA 干擾寡核苷酸。
Section.02
siRNA、miRNA 和 ASO
如何介導(dǎo)基因沉默？
miRNA、siRNA 屬于雙鏈 RNA，一般包含 20 個(gè)左右的核苷酸。短發(fā)夾 RNA (shRNA) 是單鏈 RNA。shRNA 被設(shè)計(jì)成能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞后，shRNA 被 Dicer 酶切割成 siRNA。
原理：miRNA、siRN 或 shRNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，短雙鏈 RNA 解旋后正義鏈被降解。反義鏈與多種蛋白組分形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC) 。RISC 中保留的反義鏈與靶基因的 mRNA 特異地互補(bǔ)，同時(shí) RISC 具有核酸酶活性，能將靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表達(dá) (圖 2) 。
值得注意的一點(diǎn)是，如果 siRNA 或者 miRNA 和 mRNA 不完全互補(bǔ)，則 siRNA 或者 miRNA 與靶基因的 3’ 端-非翻譯區(qū)的序列形成非完全互補(bǔ)的雜交雙鏈，miRISC 結(jié)合在雜交雙鏈上，特異性的抑制基因表達(dá)。
圖 2. siRNA、miRNA、shRNA、ASO 的作用機(jī)制[1]。
反義寡核苷酸 (ASOs) 通常指的是短小的、人工合成的單鏈 DNA 或 RNA (13 至 30 個(gè)核苷酸)。反義寡核苷酸的作用機(jī)制主要包括兩種方式：一是通過空間阻擋，干擾其他分子與靶 RNA 的結(jié)合；二是誘導(dǎo)靶 mRNA 降解。反義寡核苷酸能夠與成熟 mRNA 結(jié)合阻止其附著在核糖體上，阻斷蛋白質(zhì)翻譯或招募 RNase H 引起 mRNA 的降解 (圖 2)。
除了上述這些 RNA 干擾技術(shù)之外，小激活 RNA (saRNA) 作為一種能夠特異性的上調(diào)基因表達(dá)的寡核苷酸，也已經(jīng)應(yīng)用于基因功能的研究中。
saRNA：
saRNA，一類非編碼 RNA，結(jié)構(gòu)類似于siRNA，但生物學(xué)功能完全相反。siRNA 可以分別與 AGO1、AGO2、AGO3 和 AGO4 四種蛋白結(jié)合以獲得活性，而 saRNA 只能被特異性地加載到 AGO2 蛋白行使功能。
saRNA 的作用機(jī)制如下：
1）外源性 saRNA 被加載到細(xì)胞質(zhì)中的 AGO2 蛋白上；
2）AGO2 蛋白通過切割和丟棄其中一條 RNA 鏈，形成一個(gè)活性的 AGO2-RNA 復(fù)合物，并進(jìn)入細(xì)胞核；
3）AGO2-RNA 復(fù)合物將結(jié)合到基因組 DNA 序列或 DNA 相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列，進(jìn)一步形成 RNA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物；
4）該復(fù)合物與 hnRNPs、RNAPⅡ 和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。
SaRNA 作為一種新興的基因調(diào)控技術(shù)，其具有的小分子量、基因特異性，以及激活基因表達(dá)的作用特點(diǎn)使其成為正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥物熱門候選。
Section.03
RNA 干擾技術(shù)的應(yīng)用
miRNA 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
miRNA 模擬物是與相應(yīng) miRNA 序列互補(bǔ)的合成雙鏈小 RNA 分子，因此在研究中常用于功能性地補(bǔ)充缺失的 miRNA。miRNA inhibitor 具有與要抑制的 miRNA 相互補(bǔ)的序列，并通過與相應(yīng) miRNA 緊密結(jié)合來阻斷其功能。
miRNA agomirs 和 miRNA antagomirs 是 miRNA mimic 和 miRNA inhibitor 的化學(xué)修飾版本，該核酸采用特殊化學(xué)修飾和末端標(biāo)記技術(shù)。無需轉(zhuǎn)染試劑即可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過尾靜脈或局部注射等方法給藥至動(dòng)物體內(nèi)。
siRNA 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
關(guān)于 siRNA，往期小 M 為大家詳細(xì)介紹過 siRNA 的機(jī)制、設(shè)計(jì)、體外轉(zhuǎn)染與注意事項(xiàng)等，詳見：干貨分享 | 如何做 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)？ (常見問題+解決方案)
對(duì)于 siRNA 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)而言，由于動(dòng)物的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì) siRNA 產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求。所以一般用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 siRNA 需要做化學(xué)修飾。MCE 的預(yù)設(shè)計(jì)套裝中的 siRNA 沒有做過化學(xué)修飾，所以不適合用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。不過我們可以提供不同化學(xué)修飾的 siRNA 的定制服務(wù)。除了常規(guī)的化學(xué)修飾以外， MCE 也提供包括 GalNAc 偶聯(lián)在內(nèi)的多種偶聯(lián)修飾方法 (圖 3)。
圖 3. 因克西蘭的化學(xué)結(jié)構(gòu)：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯(lián)介導(dǎo)的肝靶向遞送。GalNAc 三聚體是典型的修飾方法[2]。
ASO 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
反義寡核苷酸 (ASO) 通過互補(bǔ)與靶標(biāo) RNA 結(jié)合，幾乎可影響 RNA 從剪接、轉(zhuǎn)錄到翻譯的各個(gè)過程。通常來說，為了增加 ASO 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，會(huì)采用例如鎖核酸 (LNA) 與硫代磷酸酯 (PS) 修飾等多種類型的化學(xué)修飾。
應(yīng)用一：實(shí)現(xiàn) mRNA 敲減
ASO 與靶標(biāo) mRNA 雜交后可以引發(fā) RNA 酶 H 的作用，并且導(dǎo)致靶標(biāo) RNA 的水解，ASO 與靶標(biāo) RNA 結(jié)合后也可以通過空間阻礙的方式抑制 mRNA 的翻譯過程。
應(yīng)用二：調(diào)節(jié)前體 mRNA 的剪接
根據(jù) pre-mRNA 序列設(shè)計(jì)的 ASO 能夠與目標(biāo) pre-mRNA 的外顯子及內(nèi)含子的交界處互補(bǔ)。ASO 與 pre-mRNA 配對(duì)形成的雙鏈區(qū)域能夠遏制該位置被識(shí)別，引起與 ASO 互補(bǔ)的外顯子在 pre-mRNA 成熟過程中被整段剪切掉。通過這種方式，可以實(shí)現(xiàn)對(duì) mRNA 可變剪接功能的研究。
應(yīng)用三：切除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)
如鑭系元素大環(huán)復(fù)合物已被證明可通過親核攻擊三磷酸鍵，特異性地化學(xué)切除 5' 端 7'-甲基鳥苷殘基。利用結(jié)合了鑭系元素大環(huán)復(fù)合物的 ASO 可以有效的去除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)。
應(yīng)用四：調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點(diǎn)
真核細(xì)胞基因通常被發(fā)現(xiàn)有不止一個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)。采用 ASO 對(duì)前體 mRNA 中的一個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合，使 E 選擇蛋白 (E-selectin) 在加尾時(shí)不得不使用上游的多聚腺苷酸化位點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點(diǎn)的目的。
Section.04
RNA 干擾技術(shù)：臨床應(yīng)用
寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強(qiáng)、高效性和長(zhǎng)效性等明顯性優(yōu)勢(shì)，成為近年來全球資本和藥企爭(zhēng)相布局的新賽道。國(guó)內(nèi)研究最多的寡核苷酸藥物類型是 siRNA，大部分處于臨床前階段，部分臨床藥物見下表。
表 1. 部分 RNA 臨床在研藥物。
Section.01
RNA 干擾技術(shù)
RNA 干擾是一種通過 RNA 分子介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制，相較于常規(guī)的抑制劑，RNA 干擾技術(shù)具有無靶點(diǎn)限制、特異性強(qiáng)、生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)。常見的應(yīng)用于 RNA 干擾的寡核苷酸有小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 等 (圖 1) ，其基本原理是利用 siRNA、miRNA 或 ASO 與特定的目標(biāo)基因 mRNA 序列相互作用，從而誘導(dǎo)靶基因的降解或抑制其翻譯，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的沉默或抑制。
圖 1. 常見的 RNA 干擾寡核苷酸。Section.02
siRNA、miRNA 和 ASO
如何介導(dǎo)基因沉默？
miRNA、siRNA 屬于雙鏈 RNA，一般包含 20 個(gè)左右的核苷酸。短發(fā)夾 RNA (shRNA) 是單鏈 RNA。shRNA 被設(shè)計(jì)成能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞后，shRNA 被 Dicer 酶切割成 siRNA。
原理：miRNA、siRN 或 shRNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，短雙鏈 RNA 解旋后正義鏈被降解。反義鏈與多種蛋白組分形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC) 。RISC 中保留的反義鏈與靶基因的 mRNA 特異地互補(bǔ)，同時(shí) RISC 具有核酸酶活性，能將靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表達(dá) (圖 2) 。
值得注意的一點(diǎn)是，如果 siRNA 或者 miRNA 和 mRNA 不完全互補(bǔ)，則 siRNA 或者 miRNA 與靶基因的 3’ 端-非翻譯區(qū)的序列形成非完全互補(bǔ)的雜交雙鏈，miRISC 結(jié)合在雜交雙鏈上，特異性的抑制基因表達(dá)。
圖 2. siRNA、miRNA、shRNA、ASO 的作用機(jī)制[1]。反義寡核苷酸 (ASOs) 通常指的是短小的、人工合成的單鏈 DNA 或 RNA (13 至 30 個(gè)核苷酸)。反義寡核苷酸的作用機(jī)制主要包括兩種方式：一是通過空間阻擋，干擾其他分子與靶 RNA 的結(jié)合；二是誘導(dǎo)靶 mRNA 降解。反義寡核苷酸能夠與成熟 mRNA 結(jié)合阻止其附著在核糖體上，阻斷蛋白質(zhì)翻譯或招募 RNase H 引起 mRNA 的降解 (圖 2)。
除了上述這些 RNA 干擾技術(shù)之外，小激活 RNA (saRNA) 作為一種能夠特異性的上調(diào)基因表達(dá)的寡核苷酸，也已經(jīng)應(yīng)用于基因功能的研究中。
saRNA：
saRNA，一類非編碼 RNA，結(jié)構(gòu)類似于siRNA，但生物學(xué)功能完全相反。siRNA 可以分別與 AGO1、AGO2、AGO3 和 AGO4 四種蛋白結(jié)合以獲得活性，而 saRNA 只能被特異性地加載到 AGO2 蛋白行使功能。
saRNA 的作用機(jī)制如下：
1）外源性 saRNA 被加載到細(xì)胞質(zhì)中的 AGO2 蛋白上；
2）AGO2 蛋白通過切割和丟棄其中一條 RNA 鏈，形成一個(gè)活性的 AGO2-RNA 復(fù)合物，并進(jìn)入細(xì)胞核；
3）AGO2-RNA 復(fù)合物將結(jié)合到基因組 DNA 序列或 DNA 相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列，進(jìn)一步形成 RNA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物；
4）該復(fù)合物與 hnRNPs、RNAPⅡ 和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。
SaRNA 作為一種新興的基因調(diào)控技術(shù)，其具有的小分子量、基因特異性，以及激活基因表達(dá)的作用特點(diǎn)使其成為正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥物熱門候選。
Section.03
RNA 干擾技術(shù)的應(yīng)用
miRNA 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
miRNA 模擬物是與相應(yīng) miRNA 序列互補(bǔ)的合成雙鏈小 RNA 分子，因此在研究中常用于功能性地補(bǔ)充缺失的 miRNA。miRNA inhibitor 具有與要抑制的 miRNA 相互補(bǔ)的序列，并通過與相應(yīng) miRNA 緊密結(jié)合來阻斷其功能。
miRNA agomirs 和 miRNA antagomirs 是 miRNA mimic 和 miRNA inhibitor 的化學(xué)修飾版本，該核酸采用特殊化學(xué)修飾和末端標(biāo)記技術(shù)。無需轉(zhuǎn)染試劑即可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過尾靜脈或局部注射等方法給藥至動(dòng)物體內(nèi)。
siRNA 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
關(guān)于 siRNA，往期小 M 為大家詳細(xì)介紹過 siRNA 的機(jī)制、設(shè)計(jì)、體外轉(zhuǎn)染與注意事項(xiàng)等，詳見：干貨分享 | 如何做 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)？ (常見問題+解決方案)
對(duì)于 siRNA 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)而言，由于動(dòng)物的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì) siRNA 產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求。所以一般用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 siRNA 需要做化學(xué)修飾。MCE 的預(yù)設(shè)計(jì)套裝中的 siRNA 沒有做過化學(xué)修飾，所以不適合用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。不過我們可以提供不同化學(xué)修飾的 siRNA 的定制服務(wù)。除了常規(guī)的化學(xué)修飾以外， MCE 也提供包括 GalNAc 偶聯(lián)在內(nèi)的多種偶聯(lián)修飾方法 (圖 3)。
圖 3. 因克西蘭的化學(xué)結(jié)構(gòu)：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯(lián)介導(dǎo)的肝靶向遞送。GalNAc 三聚體是典型的修飾方法[2]。ASO 有哪些應(yīng)用場(chǎng)景？
反義寡核苷酸 (ASO) 通過互補(bǔ)與靶標(biāo) RNA 結(jié)合，幾乎可影響 RNA 從剪接、轉(zhuǎn)錄到翻譯的各個(gè)過程。通常來說，為了增加 ASO 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，會(huì)采用例如鎖核酸 (LNA) 與硫代磷酸酯 (PS) 修飾等多種類型的化學(xué)修飾。
應(yīng)用一：實(shí)現(xiàn) mRNA 敲減
ASO 與靶標(biāo) mRNA 雜交后可以引發(fā) RNA 酶 H 的作用，并且導(dǎo)致靶標(biāo) RNA 的水解，ASO 與靶標(biāo) RNA 結(jié)合后也可以通過空間阻礙的方式抑制 mRNA 的翻譯過程。
應(yīng)用二：調(diào)節(jié)前體 mRNA 的剪接
根據(jù) pre-mRNA 序列設(shè)計(jì)的 ASO 能夠與目標(biāo) pre-mRNA 的外顯子及內(nèi)含子的交界處互補(bǔ)。ASO 與 pre-mRNA 配對(duì)形成的雙鏈區(qū)域能夠遏制該位置被識(shí)別，引起與 ASO 互補(bǔ)的外顯子在 pre-mRNA 成熟過程中被整段剪切掉。通過這種方式，可以實(shí)現(xiàn)對(duì) mRNA 可變剪接功能的研究。
應(yīng)用三：切除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)
如鑭系元素大環(huán)復(fù)合物已被證明可通過親核攻擊三磷酸鍵，特異性地化學(xué)切除 5' 端 7'-甲基鳥苷殘基。利用結(jié)合了鑭系元素大環(huán)復(fù)合物的 ASO 可以有效的去除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)。
應(yīng)用四：調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點(diǎn)
真核細(xì)胞基因通常被發(fā)現(xiàn)有不止一個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)。采用 ASO 對(duì)前體 mRNA 中的一個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合，使 E 選擇蛋白 (E-selectin) 在加尾時(shí)不得不使用上游的多聚腺苷酸化位點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點(diǎn)的目的。
Section.04
RNA 干擾技術(shù)：臨床應(yīng)用
寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強(qiáng)、高效性和長(zhǎng)效性等明顯性優(yōu)勢(shì)，成為近年來全球資本和藥企爭(zhēng)相布局的新賽道。國(guó)內(nèi)研究最多的寡核苷酸藥物類型是 siRNA，大部分處于臨床前階段，部分臨床藥物見下表。
表 1. 部分 RNA 臨床在研藥物。
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產(chǎn)品推薦 |
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Patisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA，靶向 Transthyretin (TTR) 信使 RNA 內(nèi)的序列。 |
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Inclisiran sodium (HY-132591A) Inclisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA (siRNA) 分子，可抑制 PCSK9 的轉(zhuǎn)錄。 |
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MicroRNA Mimic Negative Control (HY-R04602) MicroRNA Mimic Negative Control 是 21 個(gè)核苷酸的 miRNA 模擬物，可作為陰性對(duì)照使用。 |
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Fomivirsen (ISIS-2922) 是一種反義 21 mer 磷酸硫寡核苷酸。 |
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Nusinersen sodium (HY-112980A) Nusinersen sodium 是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。 |
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Mipomersen sodium (ISIS 301012) 是載脂蛋白 B (apoB) 的反義寡核苷酸抑制劑。 |
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Inotersen (ISIS-420915) sodium 是一種 2'-O-甲氧基乙基修飾的反義寡核苷酸。 |
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Givosiran (ALN-AS1) 是一種小干擾 RNA，靶向肝臟氨基纖維素合酶 1 (ALAS1) 信使 RNA。 |
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Bepirovirsen sodium (HY-147217A) Bepirovirsen sodium 是一種反義寡核苷酸，靶向所有 HBV 信使 RNAs。 |
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Nusinersen是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。 |
[1] Weng Y, et al. RNAi therapeutic and its innovative biotechnological evolution. Biotechnol Adv. 2019 Sep-Oct;37(5):801-825.
[2] Ebenezer O, et al. Development of Novel siRNA Therapeutics: A Review with a Focus on Inclisiran for the Treatment of Hypercholesterolemia. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4019.
標(biāo)簽：
RNA干擾
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