對(duì)不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄組展開(kāi)深入分析，篩選出多個(gè)在不同組織區(qū)域間表達(dá)差異顯著的基因，推測(cè)這些基因可能是早期 CRC 的理想生物標(biāo)志物。下一步通過(guò) IHC 驗(yàn)證這些差異基因的表達(dá)變化是否與蛋白質(zhì)豐度變化相符，以確認(rèn)所選候選生物標(biāo)志物（差異蛋白）可作為臨床生物標(biāo)志物。
（2）CRC 腫瘤發(fā)生過(guò)程中上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞富集不同生物學(xué)過(guò)程
利用 Wiki Pathways database 進(jìn)行富集分析，篩選出 7 個(gè)與不同程度惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的通路簇（C1-C7）。上皮細(xì)胞以富集 C1、C2、C4 中的通路為主，涉及增殖、DNA 損傷修復(fù)及代謝等生物學(xué)過(guò)程；C3 中的通路在上下皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞中均富集，與腫瘤進(jìn)展具有相關(guān)性；基質(zhì)細(xì)胞主要富集 C5、C6、C7 中的通路，關(guān)聯(lián)免疫抑制等惡性腫瘤發(fā)展生物學(xué)過(guò)程。說(shuō)明腫瘤發(fā)生存在顯著轉(zhuǎn)錄組改變，且有惡性腫瘤相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，這些過(guò)程特異性富集于腫瘤上皮或基質(zhì)細(xì)胞。
（3）結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程中的免疫變化，與 CD47-SIRPα 軸信號(hào)上調(diào)有關(guān)
經(jīng)富集分析篩選出大量免疫相關(guān)通路，接下來(lái)重點(diǎn)分析不同組織學(xué)區(qū)域間腫瘤（免疫）微環(huán)境的差異。利用免疫細(xì)胞反卷積算法計(jì)算各 ROI 內(nèi)特定細(xì)胞亞群的相對(duì)豐度，結(jié)果表明從正常組織到癌組織，免疫細(xì)胞相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的相對(duì)豐度則升高。為更全面表征免疫微環(huán)境，進(jìn)一步實(shí)施 WikiPathways 通路富集分析與差異基因分析，發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化早期存在炎癥反應(yīng)，CRC 發(fā)生時(shí)先天免疫反應(yīng)被激活；同時(shí)，CD276（B7-H3）和 SIRPA（SIRPα）在高級(jí)別增生區(qū)域與癌區(qū)域的基質(zhì)中表達(dá)增加。
接下來(lái)借助 IHC 對(duì)差異基因 CD276、SIRPA 進(jìn)行蛋白層面驗(yàn)證，結(jié)果顯示從正常結(jié)直腸組織到癌組織，CD47 和 SIRPα 的表達(dá)呈逐步上升趨勢(shì)，說(shuō)明結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與 CD47-SIRPα 軸信號(hào)上調(diào)有關(guān)。
（4）巨噬細(xì)胞亞型在從正常組織到癌癥的進(jìn)展過(guò)程發(fā)生轉(zhuǎn)變
為更精準(zhǔn)表征免疫微環(huán)境的改變，運(yùn)用成像質(zhì)譜流式（IMC）技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從正常結(jié)直腸組織到癌組織，特定巨噬細(xì)胞群（CD68、CD163、HLA-DR、CD204）的相對(duì)豐度有顯著變化。為明確巨噬細(xì)胞亞型，研究者采用前人已發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集開(kāi)展分析，結(jié)果顯示從正常結(jié)腸組織到發(fā)育異常再到腫瘤轉(zhuǎn)變過(guò)程中，髓系細(xì)胞浸潤(rùn)增多，巨噬細(xì)胞發(fā)生從促炎癥性 HLA-DR+ CD204 + 亞型向 HLA-DR-CD204 + 免疫抑制亞型的轉(zhuǎn)變。
3、結(jié)論
該研究聯(lián)合 DSP 空間組學(xué)、IMC 和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析技術(shù)，從空間生物學(xué)角度深入剖析 CRC 惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組與免疫學(xué)變化，不僅揭示了 CRC 發(fā)病和進(jìn)展的生物學(xué)機(jī)制，還確定了與疾病進(jìn)展密切關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物，以及有望應(yīng)用于臨床免疫治療的潛在靶標(biāo) CD47-SIRPα。
樂(lè)備實(shí)是國(guó)內(nèi)專(zhuān)注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專(zhuān)家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。
