基于Cytation成像的腸道屏障功能快速評(píng)估方案
引言
腸道屏障在防止有害物質(zhì)的全身性暴露中起著至關(guān)重要的作用。藥物或病原體對(duì)腸上皮細(xì)胞的破壞會(huì)導(dǎo)致屏障功能受損，從而增加潛在有害腸道內(nèi)容物的吸收。在藥物開發(fā)過(guò)程中，如果能夠早期識(shí)別到具有誘導(dǎo)通透性的藥物有助于更好地確定先導(dǎo)化合物的優(yōu)先級(jí)，并減少具有嚴(yán)重腸道毒性的藥物進(jìn)入后續(xù)開發(fā)階段。
基于 3D 水平的腸道屏障研究
材料與方法
01 MIMETAS OrganoPlate® 平臺(tái)：
MIMETAS 的 OrganoPlate® 技術(shù)，是一種用于體外器官模型的高通量 3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，使用常用的 384 孔微孔板，支持多達(dá) 96 個(gè)單獨(dú)的組織模型。該平臺(tái)的底部由兩層光學(xué)級(jí)玻璃組成，中間由一層薄薄的微流體通道隔開，通過(guò)無(wú)泵無(wú)管式灌注系統(tǒng)從進(jìn)樣孔向組織樣本輸送培養(yǎng)基，從而簡(jiǎn)化工作流程、提高效率和重現(xiàn)性。在“腸道屏障功能檢測(cè)解決方案”中，推薦使用 OrganoPlate® 3-lane 40（MIMETAS BV, 4003 400B）—— 采用 40 個(gè)獨(dú)立的腸道芯片，通過(guò)熒光染料來(lái)評(píng)估化合物對(duì)屏障功能的影響。
02 細(xì)胞培養(yǎng)：
使用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系 Caco-2 在器官芯片中制備腸道模型。OrganoPlate® 3-lane 40 的每個(gè)芯片由 9 個(gè)孔（3 x 3）組成，通過(guò)三個(gè)微流體通道（寬 400 µm，高 220 µm）連接。
03 屏障完整性檢測(cè)：
在培養(yǎng)的第 6 天，向培養(yǎng)基通道 1 中加入含有熒光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine(0 至 50 µM)的培養(yǎng)基，并立即使用 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)器官芯片進(jìn)行成像。
Cytation 1 系統(tǒng)具有完善的環(huán)境控制，包括CO2/O2濃度控制和溫度控制，將系統(tǒng)溫度設(shè)置并維持在 37 ℃，在24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)捕獲一次每個(gè) OrganoPlate® 芯片的熒光圖像。
結(jié)果與討論
Caco-2 細(xì)胞在 OrganoPlate® 3-lane 40 中培養(yǎng)，并用 Staurosporine(0 至 50 µM，24 小時(shí))處理，然后使用 Cytation 1 評(píng)估其屏障完整性。
圖 3-4 數(shù)據(jù)觀察到：未加細(xì)胞和 0 µM Staurosporine 條件作為對(duì)照，顯示出預(yù)期的圖像和接近 1 和 0 的泄漏分?jǐn)?shù)。
圖 5 顯示在 Staurosporine 處理的細(xì)胞中，觀察到劑量和時(shí)間依賴性的屏障完整性喪失，表現(xiàn)為兩種熒光染料從培養(yǎng)基向凝膠通道的滲透。通過(guò)計(jì)算泄露分?jǐn)?shù)和表觀滲透率（Papp），進(jìn)一步量化了屏障功能的破壞程度。
本文介紹了一種利用 Agilent BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀結(jié)合 MIMETAS OrganoPlate® 平臺(tái)評(píng)估 3D 腸道組織屏障完整性的方法。這兩個(gè)平臺(tái)共同提供了一個(gè)用戶友好的界面，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和分析的快速高效方法。該方法為藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過(guò)程中評(píng)估腸道屏障功能提供了一種強(qiáng)大的工具，有助于識(shí)別可能導(dǎo)致腸道屏障破壞的化合物，并加速安全有效藥物的研發(fā)。
除此之外，如果想要在器官芯片上進(jìn)行更高分辨率的 3D 組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，推薦使用增加了轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)的 Cytation 高級(jí)型號(hào)：Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測(cè)系統(tǒng)。
圖 6. Caco-2 OrganoPlate® 的 3D 渲染。使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦成像系統(tǒng)在 40 倍物鏡下獲取共聚焦熒光圖像。以 1 µm的步進(jìn)在多個(gè) z 高度采集 3 x 3 圖像拼接，跨越 150 微米的 Z 高度范圍。細(xì)胞核用 Hoechst 33342 標(biāo)記，細(xì)胞膜用 GFP 標(biāo)記。3D 渲染使用安捷倫 BioTek Gen5 軟件中的 3D 查看器工具生成。
Cytation的獨(dú)特性：
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開發(fā)。
腸道屏障在防止有害物質(zhì)的全身性暴露中起著至關(guān)重要的作用。藥物或病原體對(duì)腸上皮細(xì)胞的破壞會(huì)導(dǎo)致屏障功能受損，從而增加潛在有害腸道內(nèi)容物的吸收。在藥物開發(fā)過(guò)程中，如果能夠早期識(shí)別到具有誘導(dǎo)通透性的藥物有助于更好地確定先導(dǎo)化合物的優(yōu)先級(jí)，并減少具有嚴(yán)重腸道毒性的藥物進(jìn)入后續(xù)開發(fā)階段。
基于 3D 水平的腸道屏障研究
腸道是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，在體外模擬腸道屏障并評(píng)估其完整性具有很大的挑戰(zhàn)，3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)例如器官芯片的出現(xiàn)和使用，為腸道屏障體外評(píng)估提供了更為理想的模型。目前，研究者使用器官芯片在模擬腸道屏障功能、評(píng)估藥物對(duì)腸道屏障的影響和研究腸道疾病的發(fā)病機(jī)制中已經(jīng)取得了一些成果。
本研究將分享安捷倫與類器官生物芯片先驅(qū) MIMETAS 聯(lián)合開發(fā)的“利用 MIMETAS OrganoPlate® 平臺(tái)和 Agilent BioTek Cytation 成像系統(tǒng)來(lái)評(píng)估腸道屏障功能的新方法”。
材料與方法
01 MIMETAS OrganoPlate® 平臺(tái)：
MIMETAS 的 OrganoPlate® 技術(shù)，是一種用于體外器官模型的高通量 3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，使用常用的 384 孔微孔板，支持多達(dá) 96 個(gè)單獨(dú)的組織模型。該平臺(tái)的底部由兩層光學(xué)級(jí)玻璃組成，中間由一層薄薄的微流體通道隔開，通過(guò)無(wú)泵無(wú)管式灌注系統(tǒng)從進(jìn)樣孔向組織樣本輸送培養(yǎng)基，從而簡(jiǎn)化工作流程、提高效率和重現(xiàn)性。在“腸道屏障功能檢測(cè)解決方案”中，推薦使用 OrganoPlate® 3-lane 40（MIMETAS BV, 4003 400B）—— 采用 40 個(gè)獨(dú)立的腸道芯片，通過(guò)熒光染料來(lái)評(píng)估化合物對(duì)屏障功能的影響。
02 細(xì)胞培養(yǎng)：
使用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系 Caco-2 在器官芯片中制備腸道模型。OrganoPlate® 3-lane 40 的每個(gè)芯片由 9 個(gè)孔（3 x 3）組成，通過(guò)三個(gè)微流體通道（寬 400 µm，高 220 µm）連接。
圖 1. 在 OrganoPlate® 3-lane 40 中構(gòu)建 Caco-2 tubule 培養(yǎng)模型
03 屏障完整性檢測(cè)：
在培養(yǎng)的第 6 天，向培養(yǎng)基通道 1 中加入含有熒光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine(0 至 50 µM)的培養(yǎng)基，并立即使用 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)器官芯片進(jìn)行成像。
Cytation 1 系統(tǒng)具有完善的環(huán)境控制，包括CO2/O2濃度控制和溫度控制，將系統(tǒng)溫度設(shè)置并維持在 37 ℃，在24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)捕獲一次每個(gè) OrganoPlate® 芯片的熒光圖像。
圖 2. 使用安捷倫 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行腸道屏障完整性測(cè)定
結(jié)果與討論
Caco-2 細(xì)胞在 OrganoPlate® 3-lane 40 中培養(yǎng)，并用 Staurosporine(0 至 50 µM，24 小時(shí))處理，然后使用 Cytation 1 評(píng)估其屏障完整性。
圖 3-4 數(shù)據(jù)觀察到：未加細(xì)胞和 0 µM Staurosporine 條件作為對(duì)照，顯示出預(yù)期的圖像和接近 1 和 0 的泄漏分?jǐn)?shù)。
圖 3. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 FITC - 葡聚糖（150 kDa）的滲透性
圖 4. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 TRITC-dextran（4.4 kDa）的滲透性
圖 5 顯示在 Staurosporine 處理的細(xì)胞中，觀察到劑量和時(shí)間依賴性的屏障完整性喪失，表現(xiàn)為兩種熒光染料從培養(yǎng)基向凝膠通道的滲透。通過(guò)計(jì)算泄露分?jǐn)?shù)和表觀滲透率（Papp），進(jìn)一步量化了屏障功能的破壞程度。
圖 5. 屏障完整性數(shù)據(jù)分析和表觀滲透率
本文介紹了一種利用 Agilent BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀結(jié)合 MIMETAS OrganoPlate® 平臺(tái)評(píng)估 3D 腸道組織屏障完整性的方法。這兩個(gè)平臺(tái)共同提供了一個(gè)用戶友好的界面，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和分析的快速高效方法。該方法為藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過(guò)程中評(píng)估腸道屏障功能提供了一種強(qiáng)大的工具，有助于識(shí)別可能導(dǎo)致腸道屏障破壞的化合物，并加速安全有效藥物的研發(fā)。
除此之外，如果想要在器官芯片上進(jìn)行更高分辨率的 3D 組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，推薦使用增加了轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)的 Cytation 高級(jí)型號(hào)：Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測(cè)系統(tǒng)。
Cytation的獨(dú)特性：
- 顯微成像和微孔板檢測(cè)的整合可同時(shí)提供細(xì)胞表型數(shù)據(jù)和定量數(shù)據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)效率
- 集成化軟件簡(jiǎn)單易用，分析模塊不設(shè)限
- 圖像采集、處理和數(shù)據(jù)分析輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流程
- 1.25 倍-100 倍物鏡，結(jié)合 7 種成像模式，為用戶提供更多選擇
- 超過(guò) 20 種熒光通道選擇，拼插式快捷更換，滿足現(xiàn)在和未來(lái)應(yīng)用
- 配置共聚焦成像和水鏡可清晰觀察3D細(xì)胞/類器官等較厚樣本
- 環(huán)境控制包括溫度和 CO2/O2 控制與監(jiān)測(cè)，無(wú)需放置培養(yǎng)箱
- 支持與自動(dòng)化設(shè)備對(duì)接，實(shí)現(xiàn)更高通量的檢測(cè)與成像分析
- 多種成像和檢測(cè)模式可進(jìn)行數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，適用于任何檢測(cè)
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開發(fā)。
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