高通量評估TGF-β誘導(dǎo)EMT：Cytation C10助力信號通路研究新突破
研究背景：TGF-β 與 EMT 的關(guān)鍵聯(lián)系
上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵過程。TGF-β 信號通路是 EMT 的核心調(diào)控軸，通過激活 SMAD2/3 磷酸化與 SMAD4 核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄因子（如 HMGA2、ZEB1、Slug）表達，進而驅(qū)動細胞表型轉(zhuǎn)變。
如何對 TGF-β/SMAD 通路的激活做全面評估，安捷倫與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究領(lǐng)導(dǎo)者 Cell Signaling Technology（CST）開展深度合作，共同開發(fā)了題為《定量評估上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中 TGF-β 信號傳導(dǎo)的高通量方法》的應(yīng)用指南。本研究以 A549 肺癌細胞為模型，通過構(gòu)建 2D 單層細胞與 3D 球體模型，系統(tǒng)評估 TGF-β1 誘導(dǎo)下的信號通路激活與細胞行為變化。
圖 1. 典型的 TGF-β/BMP/SMAD 信號通路（adaptation)
實驗設(shè)計：從分子水平到多細胞的全景式分析
生化水平
定量分析 TGF-β1 誘導(dǎo)的 SMAD2/3 磷酸化程度，明確信號通路激活的劑量效應(yīng)與敏感性。
圖 2. TGF-β1 對 SMAD2/3 磷酸化的劑量依賴性
- 使用 PathScan ELISA 檢測 SMAD2/3 在 Ser465/467 和 Ser423/425 位點的磷酸化水平
- 計算 EC₅₀ 值以評估通路激活強度
- 與總 SMAD2/3 蛋白量歸一化處理
觀察信號分子在細胞內(nèi)的空間分布變化，驗證 SMAD 核轉(zhuǎn)位及 EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達變化。
圖 3. TGF-β1 介導(dǎo)的 SMAD 磷酸化和空間易位可在 A549 細胞中定量表達。
- 通過免疫熒光成像觀察 SMAD2/3 磷酸化后是否轉(zhuǎn)位至細胞核
- 檢測 EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（HMGA2、ZEB1、Slug）表達變化
- 評估 TGF-β 受體抑制劑 SB431542 的干預(yù)效果
模擬腫瘤微環(huán)境，評估細胞遷移行為與 SMAD4 在 3D 球體中的定位，反映 EMT 表型變化。
圖 4. 在 3D 細胞模型中，量化磷酸化的 SMAD2/3 和 SMAD4 核易位
- 構(gòu)建 A549 細胞 3D 球體模型，嵌入膠原基質(zhì)中培養(yǎng)
- 觀察 TGF-β1 處理后細胞從球體核心向外遷移的行為
- 檢測 SMAD4 在遷移細胞中的核定位情況
在這項研究中，安捷倫和 CST 的應(yīng)用科學家團隊圍繞 TGF-β 誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，構(gòu)建了一個從分子到多細胞層級的高通量分析體系。通過 PathScan ELISA 定量 SMAD2/3 磷酸化，結(jié)合 Cytation C10 共聚焦成像觀察其核轉(zhuǎn)位，并在 3D 球體模型中追蹤細胞遷移與 SMAD4 定位，全面還原了信號通路激活到表型轉(zhuǎn)變的全過程。
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