雙特異性抗體（BsAb）的結(jié)構(gòu)和結(jié)合活性傳統(tǒng)表征方法優(yōu)缺點(diǎn)

BsAb簡(jiǎn)介
1960年，美國(guó)Nisonoff課題組首次提出雙特異性抗體（BsAb）的概念。作為一種通過(guò)細(xì)胞融合、重組DNA或蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建的人工抗體，BsAb能同時(shí)結(jié)合兩種不同抗原，展現(xiàn)出比單克隆抗體（mAb）或聯(lián)合療法更卓越的治療潛力。

目前，全球已有22款BsAb藥物獲批上市，主要集中在腫瘤領(lǐng)域。2024年全球BsAb市場(chǎng)規(guī)模約130億美元，預(yù)計(jì)到2032年將爆發(fā)式增長(zhǎng)至2246億美元。僅2025年上半年，中國(guó)BsAb License-out交易總額就高達(dá)92.57億美元，CD3靶向的TCE雙抗、PD-1/VEGF雙抗等成為熱門(mén)布局方向。

表1. 中國(guó)近年BsAb交易事件（部分）

在結(jié)構(gòu)上，BsAb可分為IgG樣和片段型兩大類；其作用機(jī)制多樣，包括細(xì)胞橋接、受體橋聯(lián)、介導(dǎo)復(fù)合物形成及“歸巢”型，極大拓展了治療應(yīng)用的邊界。

圖1. 雙特性抗體結(jié)構(gòu)示例（doi: 10.3390/ijms22105350.）

圖2. BsAb作用機(jī)制示意圖（doi: 10.3390/ijms22105350.）

BsAb結(jié)合活性表征方法
雙抗結(jié)合活性的檢測(cè)絕非兩個(gè)單抗檢測(cè)的簡(jiǎn)單疊加。它是一個(gè)需要精心設(shè)計(jì)、相互驗(yàn)證的系統(tǒng)工程，旨在確保雙抗分子不僅能結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)，而且是以正確的結(jié)構(gòu)、恰當(dāng)?shù)谋壤�和期望的方式同時(shí)結(jié)合，從而驅(qū)動(dòng)其預(yù)期的生物學(xué)功能。因此，無(wú)論是在檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證還是在整個(gè)質(zhì)控流程中，其復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性都遠(yuǎn)高于單抗。傳統(tǒng)表征方法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和表面等離子共振（SPR），雖技術(shù)成熟，但在BsAb的應(yīng)用中存在明顯瓶頸：固相界面效應(yīng)、難以模擬協(xié)同結(jié)合、操作繁瑣、通量有限。

表2. 雙特異性抗體結(jié)合活性傳統(tǒng)表征方法

瑞孚迪（Revvity）的Alpha與HTRF均相檢測(cè)技術(shù)為BsAb的高通量篩選與質(zhì)控提供了高效解決方案，憑借其卓越的信噪比、操作簡(jiǎn)便性、高重復(fù)性及更貼近生理狀態(tài)的溶液相反應(yīng)環(huán)境輕松克服傳統(tǒng)方法的局限性，尤其適用于弱親和力相互作用的檢測(cè)，顯著加速BsAb的開(kāi)發(fā)與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)進(jìn)程。

Alpha/HTRF技術(shù)原理
Alpha技術(shù)是基于供體微珠和受體微珠間的近距離放大的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，HTRF技術(shù)是基于銪或鋱的穴狀化合物（供體）與XL665或d2（受體）之間的時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，兩者均基于均相檢測(cè)技術(shù)原理，即所有組分在溶液中自由反應(yīng)并直接讀數(shù)，無(wú)需洗滌步驟。

圖3. Alpha/HTRF原理示意圖

Alpha/HTRF檢測(cè)模型
不同結(jié)構(gòu)類型的BsAb都可以使用HTRF/Alpha技術(shù)來(lái)表征結(jié)合活性，以IgG樣BsAb為例，其結(jié)合活性可通過(guò)帶有不同標(biāo)簽的抗原（如生物素化抗原與His標(biāo)簽化抗原）及相應(yīng)標(biāo)簽抗體的toolbox試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表2. Alpha/HTRF檢測(cè)模型示意圖和實(shí)驗(yàn)流程

Alpha/HTRF技術(shù)優(yōu)勢(shì)

• 高度模擬天然狀態(tài)：
  均相反應(yīng)，避免固相化帶來(lái)的構(gòu)象改變問(wèn)題，能更真實(shí)地反映結(jié)合活性。
• 適用于協(xié)同結(jié)合檢測(cè)：
  其信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制要求雙抗同時(shí)結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)，可直接、高效地定量評(píng)估BsAb的雙特異性功能活性，而非簡(jiǎn)單的單價(jià)結(jié)合。
• 卓越的弱結(jié)合檢測(cè)能力：
  其均相體系與高信噪比特性，能有效捕捉低親和力的微弱結(jié)合事件，精準(zhǔn)解析BsAb與靶點(diǎn)間的弱相互作用（低至pmol-μmol級(jí)）。
• 高通量與高效率：
  免洗操作步驟大幅簡(jiǎn)化流程和減少誤差，檢測(cè)流程約2-3 h，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適合大規(guī)模篩選和常規(guī)放行測(cè)試。
• 高靈敏度與低樣本消耗：
  優(yōu)異的信噪比，僅使用極少的樣本量（約2~5 μl）便可輕松檢測(cè)BsAb的結(jié)合。
• 操作便捷：
  整個(gè)操作過(guò)程僅需添加試劑、孵育讀數(shù)即可定量或檢測(cè)BsAb結(jié)合活性。

案例分享
1.使用Alpha/HTRF技術(shù)，BsAb結(jié)合活性既可通過(guò)設(shè)置不同的結(jié)合實(shí)驗(yàn)獲得BsAb結(jié)合活性的EC50值（三元復(fù)合物-夾心法，圖4,5），或BsAb篩選的IC50值（競(jìng)爭(zhēng)法，圖6），其靈活的檢測(cè)模型滿足了客戶對(duì)BsAb結(jié)合活性驗(yàn)證的個(gè)性化要求。

圖4. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb檢測(cè)模型

圖5. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb的結(jié)合量效

圖6. 使用未標(biāo)記目標(biāo)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)法結(jié)果

2.瑞孚迪基于AlphaPlex™技術(shù)，使用不同熒光微球（Eu/Tb），通過(guò)捕獲不同的發(fā)射波長(zhǎng)區(qū)分Eu/Tb微球信號(hào)，可在同一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)BsAb與兩個(gè)不同靶點(diǎn)的結(jié)合。AstraZeneca開(kāi)發(fā)的BsAb AlphaPlex方法在50~150%線性范圍內(nèi)表現(xiàn)出99%~107%的準(zhǔn)確率，并檢測(cè)到光應(yīng)激和熱應(yīng)激條件下>50%的結(jié)合降解。此方法適用于BsAb的先導(dǎo)分子篩選、PK/PD分析、臨床相容性、商業(yè)批次放行和穩(wěn)定性測(cè)試等。

圖7. AstraZeneca的BsAb binding檢測(cè)模型、穩(wěn)定性研究和方法學(xué)驗(yàn)證（doi: 10.1016/j.jim.2021.113099.）

3.瑞孚迪基于AlphaLISA™技術(shù)，BsAb在37℃下孵育12天后，檢測(cè)到BsAb的結(jié)合活性受到了影響；基于AlphaPlex™技術(shù)，進(jìn)一步揭示了BsAb在37℃下，BsAb與PD-L1的結(jié)合是穩(wěn)定的，但與TIGIT的結(jié)合能力則受到了影響。AlphaPlex™特別適用于分析某個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能力是否受損。

圖8. BsAb強(qiáng)制降解研究

4.在某些雙特異性抗體中，可能存在與抗原結(jié)合親和力較低的情況。例如，為降低毒性效應(yīng)，部分T細(xì)胞銜接器（TCE）類藥物會(huì)通過(guò)工程化改造降低其與CD3的結(jié)合強(qiáng)度。若采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，洗滌步驟易導(dǎo)致此類低親和力結(jié)合復(fù)合物的解離，從而無(wú)法有效捕獲信號(hào)或CV值較大。而瑞孚迪的Alpha/HTRF平臺(tái)作為一種均相檢測(cè)技術(shù)，無(wú)需洗滌步驟，可在溶液相中直接檢測(cè)低至微摩爾（μM）級(jí)別的弱分子互作，顯著提高對(duì)低親和力結(jié)合事件的檢測(cè)靈敏度。

圖9. 低親和力分子互作案例（doi: 10.1021/acschembio.6b00286.）